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Immunology and Infection

Generación de mayor biomasa de biopelícula bacteriana utilizando dispositivos de microplacas de pozo profundo de placas pcr

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63069
, , , ,
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases,University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory,Public Health Agency of Canada

Summary

Este protocolo presenta una metodología para realizar mediciones de crecimiento de biopelículas y biomasa utilizando dispositivos de placa de PCR de pozo profundo autoensamblados para la detección de biopelícula estática de tapa fijada de 96 pocillos de alto rendimiento.

Abstract

Las biopelículas bacterianas son difíciles de erradicar de las superficies utilizando intervenciones antimicrobianas convencionales. Los métodos de microplacas de 96 pocillos de alto rendimiento se utilizan con frecuencia para cultivar biopelículas bacterianas para pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana para calcular valores mínimos de concentración de erradicación de biopelículas (MBEC). Los dispositivos de biopelícula estándar consisten en tapas fijadas de poliestireno instaladas en microplacas de 96 pocillos y son ideales para medir la biomasa de biopelícula y los valores de MBEC, pero estos dispositivos están limitados por el área de superficie de clavija disponible para la acumulación y el costo de la biomasa. Aquí, describimos un protocolo para usar el dispositivo de tapa fija de placa de PCR de polipropileno de 96 pocillos profundos autoensamblado para cultivar biopelículas PAO1 de Escherichia coli BW25113 y Pseudomonas aeruginosa . Se describe una comparación de biopelículas de 24 horas formadas en dispositivos de pozos estándar y profundos por cada especie utilizando tinción de biomasa violeta cristalina y ensayos de determinación de MBEC. Se espera que la mayor superficie de los dispositivos de pozos profundos aumente la formación general de biopelículas por ambas especies de 2 a 4 veces. P. aeruginosa formó una biomasa significativamente mayor / mm2 en clavijas de pozos profundos en comparación con el dispositivo estándar. E. coli tuvo mayor biomasa / mm2 en dispositivos de poliestireno estándar en comparación con el dispositivo de pozo profundo. Los ensayos de erradicación de biopelículas con desinfectantes como el hipoclorito de sodio (lejía) o el cloruro de benzalconio (BZK) mostraron que ambos compuestos podrían eliminar las biopelículas de E. coli y P. aeruginosa de ambos dispositivos, pero a diferentes valores de MBEC. La erradicación de la biopelícula BZK dio lugar a valores variables de MBEC de E. coli entre dispositivos, sin embargo, la lejía demostró valores de MBEC reproducibles tanto para especies como para dispositivos. Este estudio proporciona un método de pozo profundo de alto rendimiento para cultivar grandes cantidades de biopelículas en dispositivos de polipropileno para estudios posteriores que requieren mayores cantidades de biopelícula estática.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli son proteobacterias Gram-negativas que se estudian comúnmente por su capacidad para formar comunidades celulares sésiles y unidas a la superficie conocidas como biopelículas1. Ambas especies, al crecer como biofilms, pueden secretar una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) compuesta principalmente por diferentes polisacáridos y proteínas, que también pueden incluir ADN extracelular y/o lípidos, proporcionando protección celular adicional y una mayor supervivencia en ambientes hostiles y limitados en nutrientes2,3. La fisiología y formación de biopelículas por ambas especies es de relevancia clínica, ya que representan los cinco principales patógenos resistentes a los antimicrobianos más comúnmente aislados de las infecciones de sangre, del tracto urinario y pulmonares de pacientes hospitalizados en Canadá4,5. También es importante tener en cuenta que se estima que las biopelículas constituyen casi el 80% de todas las infecciones crónicas y recurrentes causadas por estas especies bacterianas6. Debido a las sustancias EPS secretadas y a la actividad metabólica más lenta7,8, las biopelículas establecidas se vuelven más difíciles de erradicar cuando se forman en superficies como dispositivos médicos implantados, tejidos cicatriciales y en los pulmones de pacientes con fibrosis quística9,10, lo que aumenta su resistencia a los antimicrobianos.

Las propiedades de crecimiento recalcitrante de los biofilms bacterianos a menudo los hacen más resistentes a la inhibición y/o erradicación antimicrobiana2,9. Por lo tanto, el establecimiento de métodos in vitro para estudiar la erradicación antimicrobiana de biopelícula bacteriana es primordial para seleccionar compuestos efectivos para erradicar las infecciones cuando se forman en plásticos médicos (por ejemplo, catéteres en la vivienda) e implantes médicos. La mayoría de los métodos rápidos de cultivo antimicrobiano de biopelícula in vitro examinan el crecimiento de biopelículas como un cultivo de biopelículas “estático” en lugar de cultivos “continuos”, donde el crecimiento bacteriano estático se monitorea en etapas tempranas a tardías de la formación de biopelículas durante un corto período de tiempo (24-96 h) en el mismo medio de crecimiento. Los métodos de biopelícula continua son engorrosos para el análisis rápido, ya que requieren que el crecimiento de la biopelícula se evalúe durante períodos de tiempo más largos cultivados en cámaras que permiten el flujo continuo y el reemplazo de medios de crecimiento con menos réplicas11. Debido al tiempo y el esfuerzo necesarios para mantener y establecer biopelículas continuas, las biopelículas estáticas in vitro son las más populares, ya que se adaptan fácilmente para ensayos de prueba de susceptibilidad antimicrobiana de alto rendimiento en placas de microtitulación de plástico de 96 pocillos en lugar de sistemas de cámaras de flujo elaborados que limitan el número de cultivos probados simultáneamente 12,13 . Los ensayos estáticos más simples de microplacas de biopelícula “en el pozo” utilizan placas de microtitulación de poliestireno o vinilo estándar (capacidad de 300 μL) para medir la formación de biopelículas en los lados y fondos de cada pozo y, a menudo, como anillos en la interfaz aire-superficie líquida. La formación de biopelículas bacterianas en el pozo se mide tiñendo la biomasa depositada adherida a los pozos después de que se elimina el líquido del medio de crecimiento y se lavan las biopelículas12,13. Estos ensayos son económicamente populares, pero a menudo tienen problemas de reproducibilidad debido a su diseño inherente, ya que las biopelículas depositadas son propensas a daños o pérdidas durante el enjuague para la recuperación celular y los procedimientos de tinción de biomasa11,14.

Para reducir las pérdidas de biopelícula, los dispositivos de biopelícula comercial estándar han mejorado los diseños de microplacas de biopelícula en el pozo al agregar una tapa de poliestireno insertable de 96 pocillos al diseño estándar de placa en el pozo 96, denominado el “dispositivo de biopelícula estándar” en este documento. La adición de una tapa fijada amplía el área de superficie disponible en cada pozo de microplaca, lo que permite una mayor adherencia a la superficie y la formación de biomasa de biopelícula15,16. Los dispositivos estándar de tapa fijada a biopelícula permiten una mayor recuperación, eliminación y enjuague de biopelículas para pruebas posteriores de susceptibilidad y erradicación de biopelículas antimicrobianas cuando se insertan tapas fijas en nuevas placas de microtitulación que contienen desafíos de medicamentos o condiciones de crecimiento. De manera similar a las técnicas de microplacas de biopelícula en el pozo, los materiales recuperados de los dispositivos de tapa fijada eliminada y lavada permiten realizar pruebas de supervivencia celular y tinción de biomasa de biopelícula, que generalmente involucran formulaciones de colorantes violeta cristalino (CV) 17,18,19. Los dispositivos de biopelícula estándar también son óptimos para detectar susceptibilidades antimicrobianas de biopelículas. Estos ensayos monitorean la inhibición del crecimiento de la biopelícula de dos maneras: 1) Cuando se agregan antimicrobianos a las células al comienzo del crecimiento, puede determinar el valor mínimo de concentración de inhibición de la biopelícula (MBIC). 2) Cuando las biopelículas establecidas se forman en las clavijas después de 24 horas y luego se exponen a los antimicrobianos, se puede determinar el valor mínimo de concentración de erradicación de biopelícula (MBEC) 17,20. Al igual que los dispositivos de microplaca de biopelícula en el pozo, los dispositivos de biopelícula estándar tienen algunas limitaciones notables, como su alto costo por dispositivo, no son esterilizables en autoclave y son menos duraderos a los solventes químicos debido al material de placa de poliestireno utilizado. Los dispositivos de biopelícula estándar también tienen una baja relación de área de superficie a clavija, lo que limita los volúmenes máximos de trabajo en cada pozo a 200 μL. Estos factores pueden hacer que los dispositivos de biopelícula estándar sean más difíciles de usar para estudios que exigen mayores cantidades de biopelícula en un formato de alto rendimiento.

Aquí, describimos un método estático de biofilm de tapa fijada de 96 pocillos desarrollado en nuestro laboratorio utilizando placas de PCR de 96 pocillos semifaldadas de polipropileno disponibles comercialmente de 0,5 ml instaladas en placas de microtitulación de 96 pocillos que tienen pozos más profundos que la placa estándar (Tabla de materiales). Estos dispositivos ensamblados tienen un volumen de trabajo máximo de 750 μL cuando se utilizan para el cultivo de biopelícula (aquí conocido como “dispositivo de biopelícula de pozo profundo”). Las ventajas de usar estos dispositivos de biopelícula de pozo profundo son su menor costo en comparación con los dispositivos de biopelícula estándar, se pueden esterilizar en autoclave y aumentan el área de superficie para la formación de biopelículas en el “tubo / clavijas” de placa de PCR externa más grande. Con este método mostramos las aplicaciones de estos dispositivos para el cultivo y caracterización de biomasa de biofilm formado por Escherichia coli BW25113 y P. aeruginosa PAO1. Los métodos para determinar los valores de MBEC utilizando ensayos de erradicación de biopelículas se describen utilizando los antimicrobianos desinfectantes del compuesto de amonio cuaternario cloruro de benzalconio (BZK) e hipoclorito de sodio (lejía). Se seleccionó el antiséptico/desinfectante BZK, ya que este compuesto se utiliza con frecuencia para inhibir las biopelículas de superficies contaminadas, pero según los informes, es menos efectivo para erradicar biopelículas bien establecidas21. La lejía es un producto químico altamente efectivo para la erradicación de biopelículas establecidas y es un pilar en la desinfección química 22. Ambos desinfectantes proporcionan una comparación útil de los valores de MBEC para cada dispositivo de biofilm21. En este artículo se resume un protocolo para esta evaluación de dispositivos de biopelícula que utiliza ensayos de tinción CV y erradicación de biopelículas para la determinación de MBEC. Se ha incluido un diagrama de flujo de protocolo para una visión general simplificada del flujo de trabajo de estos métodos (Figura 1).

Protocol

1. Preparación de cultivo aséptico para el crecimiento de biopelículas (Días 0-1) El día 0, raye la(s) cepa(s) bacteriana(s) deseada(s) para la prueba de una cepa crioconservada (en glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO)) directamente sobre una placa de agar nutriente con selección antimicrobiana según lo requiera la cepa. Incubar placas de agar a la temperatura óptima (37 °C) y tiempo (18-22 h) para el crecimiento de la cepa. Al día siguiente (Día 1), inocular una colonia de la placa de agar en 5 mL de medios de crecimiento en condiciones óptimas de crecimiento. Estos cultivos se utilizarán como inoculaciones iniciales del Día 2 para dispositivos de biopelícula (ver paso 2.2; Figura 1).NOTA: Para este estudio, E. coli K-12 BW21153 y P. aeruginosa PAO1 se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) a 37 °C durante 18 h con agitación a 160 revoluciones por minuto (rpm). Preparar al menos 3 cepas cultivadas de forma independiente para generar réplicas biológicas para la medición de biopelículas debido a la variabilidad estadística de la formación de biomasa de biopelículas en los dispositivos de tapa fijada. 2. Preparación e inoculación de placas (Día 2) Llene los pozos exteriores de una placa de polipropileno autoclave de 96 pocillos, 1,1 ml/pozo con agua estéril de 750 μL/pozo (Figura 2A). Llene los pozos de control negativos (pozos de medios no ininoculados; columna B) con medios de crecimiento de 750 μL y los pozos restantes con medios de crecimiento de 675 μL.NOTA: El paso 2.1 anterior y los pasos a continuación enumeran los volúmenes apropiados para el dispositivo de biopelícula de pozo profundo. Si se utiliza el dispositivo de biopelícula estándar, los volúmenes se cambiarán de la siguiente manera: 75 μL de cultivo de inóculo a 20 μL; 675 μL de medios de crecimiento a 180 μL; 750 μL de agua estéril / medios de crecimiento a 200 μL; 800 μL de soluciones de tinción CV/ácido acético/enjuague a 210 μL. Además, para el paso 3.6 a continuación, la absorbancia a 500 nm (A550 nm) se puede leer directamente en la microplaca de poliestireno después de mezclar cuando se utiliza la microplaca estándar del dispositivo de biopelícula. Usando cultivos nocturnos del Día 1, estandarice los cultivos a una densidad óptica a 600 nm (OD600nm) = 1.0 o a un estándar McFarland de 0.5-1 unidades. Cree una dilución en serie de 10 veces de cada cultivo estandarizado en tubos de ensayo o una placa de microtitulación de pozo profundo de 96 pocillos hasta que se alcance una dilución de 10-3 . Inocular los medios que contienen pocillos como se muestra en la Figura 2B con 75 μL del cultivo diluido 1 x 10-3 , para una dilución bacteriana final en el pozo de 10-4. Inserte cuidadosamente una placa de PCR en autoclave (tapa fijada) en la placa de pozo profundo inoculada. Incubar placas en condiciones óptimas de deformación (37 °C) con agitación (máximo 160 rpm) en una incubadora con 50-60% de humedad durante 24 h. 3. Determinación de biomasa de biofilm a partir de dispositivos que utilizan tinción CV (Día 3) Retire asépticamente la tapa fijada de biopelícula de cada dispositivo y enjuague insertando en una placa de pozo profundo en autoclave preparada con 800 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) / pozo durante 30 s para eliminar las células planctónicas. Para la tinción de biomasa CV, transfiera la tapa de la placa de PCR fijada a una nueva placa preparada con 800 μL/pozo 0,1% (p/v) CV en dH2O y manche durante 5 minutos. Elimine el exceso de manchas enjuagando la tapa fijada en una placa de pozo profundo preparada con PBS estéril de 800 μL/pozo. Deje que las placas se sequen durante 10 minutos en un gabinete de bioseguridad con clavijas hacia arriba. Transfiera la tapa de la placa de PCR seca a una placa que contenga 800 μL/pocillo 30% (v/v) de ácido acético y deje que la tapa se desmanche durante 5 minutos. Retire la tapa de la clavija PCR manchada y mezcle bien la solución mediante pipeteo. Transfiera 200 μL de las placas de pozo profundo a una microplaca estándar de 96 pocillos y mida la absorbancia de la solución de desmanchación a una longitud de onda de 550 nm (A550nm) en un lector de microplacas de rango ultravioleta (UV) / visible (Vis). Utilizando los valores medidos de A550nm , reste el valor promedio de A550nm en blanco (control negativo) de cada valor de muestra de biopelícula. Promedio de cada valor de muestra de biopelícula A550nm restado en blanco que representa las réplicas biológicas de la muestra. 4. Desafiar a las biopelículas con antimicrobianos para calcular su valor de MBEC antimicrobiano de 24 h (Día 3) Prepare una solución madre antimicrobiana en agua que sea dos veces (2x) la concentración de la concentración antimicrobiana más alta deseada para ser probada. Cree una serie de dilución doble de la solución madre antimicrobiana en 2x medios de crecimiento concentrados para que haya 8 concentraciones de antimicrobianos. Como se muestra en la Figura 2B, llene los pozos exteriores de una placa de pozo profundo en autoclave con agua estéril de 750 μL/pozo. Llene las columnas B (control negativo; sin bacterias) y C (control positivo; sin exposición a antimicrobianos) de la placa con medios de crecimiento de 750 μL/pozo. Llene los pocillos restantes con 750 μL/pocillo de la serie de dilución antimicrobiana como se muestra en la Figura 2B. Retire y enjuague la tapa pegada como se describe en el paso 3.1 y transfiérala a la placa de desafío antimicrobiano. Incubar placas con agitación (máx. 160 rpm) en condiciones de deformación adecuadas y para el período de exposición deseado. 5. Recuperación de biomasa de biofilm a partir de tapas pegadas (Día 4) Retire las tapas adhesivas expuestas a antimicrobianos y enjuague como se describe en el paso 3.1. Transfiera la tapa fijada a una placa de pozo profundo con medios de recuperación de 750 μL/ pozo en los pozos internos y 750 μL/pozo estéril dH2O en los pozos exteriores. Para preparar medios de recuperación de 70 ml, combine 35 ml de 2 lb concentrados, 0,7 ml de 100% tween-20, 3,5 ml de solución neutralizante universal 20 ml y 30,8 ml de dH2O estéril en un frasco estéril. Para preparar 20x solución neutralizante universal concentrada, agregue 1.0 g de L-histidina, 1.0 g de L-cisteína y 2.0 g de glutatión reducido a un volumen final de 20 mL de dH2O. El filtro esteriliza la solución a través de un filtro de 0.2 μm y guárdela a 4 °C. Coloque el dispositivo del paso 5.1 en un contenedor secundario instalado dentro de un baño de agua sonicante. Sonicar los dispositivos durante 30 minutos para desalojar la biopelícula de las clavijas en el medio de recuperación. Después de la sonicación, retire la tapa fijada y coloque una tapa de cubierta de placa plana estéril en la placa de medios de recuperación de pozo profundo. La tapa fijada se puede desechar. Incubar placas con medios de recuperación a partir del paso 5.3 en las condiciones óptimas de crecimiento de la deformación durante la noche (16-18 h). 6. Determinación de los valores de MBEC del dispositivo (Día 5) Al día siguiente, transfiera 200 μL de cada pozo de la placa de pozo profundo incubada del paso 5.4 a una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos. Lea el OD600nm de cada pozo utilizando un lector de microplacas de rango UV/Vis. Reste los valores de control negativo (en blanco no inoculado) OD600nm de cada biopelícula que contenga el pozo de muestra. Calcule el valor de MBEC para cada muestra utilizando valores de OD600nm , donde el valor de MBEC es la concentración antimicrobiana más baja que resultó en el valor más bajo de OD600nm (indistinguible del control no ininoculado) para una muestra específica de especie/cepa tratada con antimicrobianos.

Representative Results

El objetivo de este estudio fue proporcionar un método para realizar mediciones de dispositivos de biopelícula estática de mayor volumen y alto rendimiento (96 pocillos) utilizando dispositivos de biopelícula de pozo profundo. Aquí, comparamos una placa de PCR semifalda autoensamblada insertada en una microplaca de pozo profundo, conocida como el dispositivo de pozo profundo, con un dispositivo de tapa fijada de biopelícula estándar comúnmente utilizado para examinar sus capacidades para formar biopelículas estáticas. Se utilizaron ensayos de biomasa teñida con CV y de erradicación de biopelículas (MBEC) para evaluar la formación de biopelículas por ambos dispositivos. Para comparar la formación de biofilm por diferentes especies en cada dispositivo, evaluamos biomasas de biofilm formadas por E. coli BW25113 y P. aeruginosa PAO1 utilizando el protocolo de tinción CV de biofilm17. Aunque la tinción CV generalmente se informa como valores de A550nm, debido a las diferencias en los volúmenes de crecimiento de cada dispositivo y sus áreas de superficie disponibles, convertimos los valores de A550nm de tinción CV a concentraciones CV molares en solución. Las concentraciones CV molares representaron las diferencias de volumen de cada dispositivo y permitieron una comparación de las concentraciones CV que representan las biomasas recuperadas de cada dispositivo. Los resultados mostraron que ambas especies produjeron significativamente más biomasa en dispositivos de biopelícula de pozos profundos (2,1 veces E. coli; 4,1 veces P. aeruginosa) en comparación con el dispositivo de biopelícula estándar (Figura 3A-B). Este resultado se esperaba dada la mayor superficie de la clavija PCR del pozo profundo (320,4 mm2) en comparación con el área de superficie de la clavija estándar del dispositivo (108,9 mm2). Este hallazgo también es consistente con el aumento de los volúmenes aumentados (750 μL) utilizados en el dispositivo de biopelícula de pozo profundo en comparación con los pozos de dispositivo estándar (200 μL). Por lo tanto, los dispositivos de pozos profundos aumentaron la acumulación de biomasa de biopelícula en las clavijas de tubo de PCR en comparación con las clavijas más pequeñas con dispositivos de biopelícula estándar. Ambos dispositivos de biopelícula formaron biopelículas reproducibles cuando comparamos biopelículas biológicamente replicadas formadas por E. coli y P. aeruginosa (Figura 3A-B). A pesar de observar una mayor variabilidad en los valores de M A550nm teñidos de CV de réplica técnica para cualquiera de las cepas cultivadas en el dispositivo de pozo profundo, no hubo diferencias estadísticamente significativas cuando comparamos los valores medios de CV M para las réplicas biológicas de cada especie en el pozo profundo o dispositivos estándar utilizando el Análisis de varianza bidireccional por pares (ANOVA) o las pruebas T de Student (ambas p > 0,05). Este hallazgo muestra que la formación de biopelículas por pozos profundos y dispositivos estándar forma biopelículas reproducibles. Sin embargo, los resultados de la tinción CV también mostraron que cuando se tuvieron en cuenta las diferencias de área de superficie de la clavija en cada dispositivo, la formación de biomasa de biopelícula por E. coli y P. aeruginosa mostró diferencias estadísticamente significativas en la acumulación de biomasa (Tabla 1). El cálculo de la biomasa media teñida con CV (M) por área de superficie de clavija en mm2 (CV M/mm2) para E. coli mostró que la formación de biopelícula fue 1,5 veces menor en los dispositivos de pozo profundo de polipropileno en comparación con el dispositivo de biopelícula estándar (Tabla 1). Sin embargo, el resultado opuesto se obtuvo para P. aeruginosa, que demostró 1,4 veces más CV M/mm2 en dispositivos de pozos profundos de polipropileno en comparación con los dispositivos de biopelícula estándar (Tabla 1). A pesar de las diferencias observadas específicas de la especie en la acumulación de biomasa de biopelícula con cada dispositivo, el dispositivo de pozo profundo aún demostró una mayor formación general (2-4 veces aumentos) de biomasa de biopelícula por cada especie (Figura 3). Para determinar las aplicaciones de prueba de susceptibilidad antimicrobiana del dispositivo de biopelícula de pozo profundo, comparamos dos desinfectantes de uso común, BZK y lejía, por su potencial de erradicación de biopelículas. Ambos productos químicos se utilizan comúnmente para prevenir (BZK) y/o erradicar (blanquear) las biopelículas bacterianas en aplicaciones clínicas e industriales21,22,23. Cada compuesto se agregó en concentraciones crecientes de 2 veces a las biopelículas formadas por E. coli y P. aeruginosa en los dispositivos de biopelícula estándar y de pozo profundo22,23 (Figuras 1, 2B). La concentración más baja de BZK o lejía que dio lugar a valores de OD600nm que eran indistinguibles de los pozos de control negativos se definió como el valor de MBEC. El tratamiento de biopelículas formadas en dispositivos de biopelícula estándar con lejía dio como resultado los mismos valores de MBEC de lejía de 0,625% para E. coli y P. aeruginosa (Tabla 1, Figura 4A-B). Los valores de MBEC de blanqueador determinados para la biopelícula de E. coli y P. aeruginosa formada en dispositivos de pozos profundos mostraron valores de MBEC 2-4 veces más bajos por ambas especies (E. coli; 0.156%; P. aeruginosa 0,313%) en comparación con dispositivos estándar (Tabla 1). Se observó una diferencia de 2 veces en los valores de MBEC de lejía entre especies para el dispositivo de pozo profundo, donde P. aeruginosa requirió una concentración 2 veces mayor de lejía para erradicar las biopelículas en comparación con E. coli (Figura 4A-B, Tabla 1). La diferencia de MBEC de blanqueador 2 veces entre P. aeruginosa y E. coli en el dispositivo de pozo profundo parece correlacionarse inversamente con un aumento de 1,5 veces la formación de biomasa teñida con CV por P. aeruginosa en comparación con E. coli (Figura 3A-B). La mayor cantidad de biomasa formada por P. aeruginosa en las clavijas de los dispositivos de pozos profundos también puede explicar por qué se requirió una mayor concentración de lejía para erradicar las biopelículas de P. aeruginosa en comparación con E. coli en pozos profundos (Figura 3A-B, Tabla 1). Por lo tanto, los ensayos de erradicación de biopelículas de dispositivos de pozos profundos muestran que ambas especies eran susceptibles a la lejía, pero a concentraciones de blanqueamiento más bajas (2-4 veces) en comparación con los dispositivos estándar. Esto se correlaciona inversamente con el área de superficie de clavija 3 veces mayor y los volúmenes de las clavijas de placa pcr del dispositivo de pozo profundo. Esto sugiere que para la exposición a la lejía, una mayor área de superficie de biomasa puede reducir las concentraciones de lejía necesarias para la erradicación de la biopelícula. Las pruebas de erradicación de biopelículas BZK mostraron una mayor variabilidad en el crecimiento recuperado (valores OD600nm) y los valores de MBEC por cada especie en comparación con los resultados de blanqueamiento (Figura 4C-D). Esta variabilidad no es inesperada en base a estudios previos que muestran que BZK fue más eficaz en la prevención de la formación de biopelículas que en la erradicación de biopelículas bien establecidas24,25,26. Utilizando el dispositivo de biopelícula estándar, solo las biopelículas de P. aeruginosa tratadas con BZK mostraron un valor de MBEC consistente (2560 μg/mL) que fue 8 veces menor que el valor de MBEC (20480 μg/mL) obtenido para esta cepa en el dispositivo de pozo profundo (Tabla 1, Figura 4C). Estos resultados pueden reflejar diferencias en las cantidades de biomasa de P. aeruginosa formada en superficies profundas bien fijadas y composiciones plásticas en comparación con las clavijas de dispositivo estándar. La erradicación de BZK de biopelículas formadas por E. coli tanto en el pozo profundo como en los dispositivos estándar fue igualmente deficiente, lo que resultó en una amplia gama de valores de BZK MBEC de 2560-40960 μg / ml para el dispositivo de pozo profundo y 320-10240 μg / ml en el dispositivo estándar (Figura 4D). Para E. coli, esta variabilidad se explicó por la instancia ocasional en la que 1-2 pozos replicados mostraron un crecimiento bajo pero estadísticamente significativo en los medios de recuperación, que aumentó el error y redujo la precisión de la determinación de BZK MBEC con cualquiera de los dispositivos (Figura 4D, Tabla 1). Esta variabilidad pone de manifiesto la ineficacia del uso de BZK en la erradicación de biofilms de E. coli como se señaló anteriormente en estudios24,25,26. En contraste, las biopelículas de P. aeruginosa podrían ser erradicadas de manera confiable por BZK a una concentración definida con ambos dispositivos, pero con una diferencia de concentración de BZK de 8 veces (Figura 4C). En resumen, los valores de MBEC de erradicación de BZK de biopelículas formadas por P. aeruginosa muestran valores distintos de MBEC con cada dispositivo, sin embargo, ambos dispositivos son igualmente pobres en la distinción de fenotipos de erradicación de BZK precisos de E. coli. Por lo tanto, el método del dispositivo de biopelícula de pozo profundo descrito en este documento es igualmente efectivo para formar biopelículas reproducibles en comparación con un dispositivo de biopelícula estándar. Figura 1. Descripción general esquemática del experimento. Día 0 aislamiento de colonias individuales de ganado criopreservado; Día 1 inoculación de medios de crecimiento con colonias individuales; Día 2 inoculación de la placa de biofilm; Día 3 Tinción CV o desafío antimicrobiano; Día 4 sonicación de biofilm en medios de recuperación; y día 5 de lectura OD600nm de la placa de recuperación para determinar los valores de MBEC. Algunas imágenes en figura proporcionadas por Servier Medical Art (smart.servier.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Diseños de placas de ejemplo que se muestran para varios pasos del protocolo. A) La configuración final de la placa para el crecimiento inicial de la biopelícula de 24 horas utilizando cultivos bacterianos del Día 1 de dos cepas bacterianas (E. coli y P. aeruginosa), cada una con tres réplicas biológicas. Los pozos de control negativos (grises) se utilizan como controles de esterilidad (sin bacterias añadidas). B) Configuración de placas para el desafío antimicrobiano de biofilms. Los colores oscuros indican un aumento de la concentración de antimicrobianos. El control negativo son los pozos sin bacterias añadidas (gris) y los controles positivos son biopelículas sin exposición a antimicrobianos (naranja). Las tapas de clavijas de biopelícula tomadas del panel A se transfieren a esta placa de pozo profundo para la exposición a antimicrobianos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. La concentración molar (M) de E. coli teñida con CV BW25113. (A) y P. aeruginosa PAO1 (B) biomasa de biopelícula recuperada de dispositivos estándar (círculos) y pozos profundos (triángulos). La tinción CV se midió leyendo la absorbancia de CV a 550 nm (A550nm), y las lecturas profundas de A550nm se ajustaron por un factor de 3.809 (800 μL / 210 μL) para tener en cuenta las diferencias de volumen entre los dispositivos. La concentración molar CV (M) fue determinada por la ley de Beer-Lambert (Concentración CV = A550nm/εl); donde se determinó que la longitud de trayectoria (l) de 210 μL en la placa de microtitulación de fondo plano de 96 pozos era de 0,56 cm y el coeficiente de extinción (ε) de CV en agua a A550nm de 251500 cm-1M-139. Los resultados representan 9 réplicas técnicas de tres réplicas biológicas de cada cepa cultivada como biopelícula y el valor medio de cada réplica biológica se muestra como una barra horizontal en cada parcela. Las diferencias estadísticamente significativas en la biomasa entre los dispositivos se determinaron entre los valores medios de réplica biológica mediante una prueba t pareada de dos colas (E. coli p= 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0.002-0.009 (**)) mostrado como barras con asteriscos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 4. Determinación de la concentración antimicrobiana de MBEC. Determinación de la concentración antimicrobiana de MBEC para lejía (A,B) y BZK (C,D) para P. aeruginosa PAO1 (A, C) y E. coli BW25113 (B,D) cuando se cultiva en dispositivos de biofilm estándar (barras blancas) y de pozo profundo (barras grises). Los resultados se determinaron mediante la lectura del OD600nm de biopelícula recuperado después de la sonicación en medios de recuperación e incubación nocturna. El pozo profundo OD600nm se ajustó por un factor de 3.75 (750 μL / 210 μL) para tener en cuenta las diferencias de volumen entre los dispositivos. Los resultados son representativos de tres réplicas biológicas y las barras de error muestran la desviación estándar entre réplicas en cada concentración antimicrobiana39. Los asteriscos (*) encima de cada gráfico de barras indican diferencias estadísticamente significativas en los valores de OD600nm de los controles en blanco con valores p < 0,05 utilizando cálculos de la prueba T de Student de dos colas. Los símbolos de círculo (o) encima de cada gráfico de barras indican mediciones en las que solo 1 o 2 réplicas tenían valores de OD600nm estadísticamente significativos de controles en blanco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. BZK MBEC (μg/ml) Blanqueador MBEC (% v/v) Prueba de cepa Dispositivo de pozo profundo Dispositivo estándar Dispositivo de pozo profundo Dispositivo estándar E. coli BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625 Dispositivo de pozo profundo Dispositivo estándar p-valor** Cambio de plegado (pozo profundo / estándar) Prueba de cepa Media CV M*/ mm2 ± SD Media CV M*/ mm2 ± SD E. coli BW25113 1,99 x 10-8 ± 3,25 x10-9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa PAO1 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4 Tabla 1. Resumen de E. coli BW25113 y P. aeruginosa PAO1 valores medios de biomasa teñida con CV M/mm2 y valores de MBEC de erradicación de biopelículas para BZK y lejía en diversos dispositivos.*Valores medios CV M/mm2 calculados utilizando valores medios de réplica biológica CV M (Figura 3).**Valores p determinados mediante la prueba T de Student de dos colas.

Discussion

Este estudio describe métodos para utilizar un dispositivo de crecimiento de biopelícula estática de alto rendimiento de 96 pocillos de mayor volumen que involucra una microplaca de pozo profundo de polipropileno equipada con una tapa de placa de PCR semifaldada para la formación de biopelícula (dispositivo de biopelícula de pozo profundo; Tabla de Materiales). Comparamos las biopelículas generadas con este dispositivo con un dispositivo de biopelícula estándar de poliestireno disponible comercialmente (Tabla de materiales). El método del dispositivo de pozo profundo utiliza los mismos pasos metodológicos y soluciones que el dispositivo estándar17 a volúmenes ajustados modificados para los dispositivos de pozo profundo, lo que hace que este dispositivo sea ideal para la formación de biopelículas a gran escala y el análisis experimental. El crecimiento de E. coli BW25113 y P. aeruginosa PAO1, dos especies Gram-negativas que se sabe que forman biopelículas, se examinaron por su formación de biomasa y los valores de MBEC desinfectante (BZK / lejía) utilizando en ambos dispositivos. La comparación de la biomasa teñida con CV formada en clavijas de cada dispositivo mostró que tanto E. coli como P. aeruginosa formaron biopelículas con mayor biomasa en el dispositivo de biopelícula de pozo profundo en comparación con el dispositivo estándar (Figura 3A-B). El aumento de la biomasa de biopelícula reflejó la mayor área de superficie de las clavijas de pozos profundos en comparación con el área de superficie de la clavija del dispositivo estándar. Cuando se tuvieron en cuenta las diferencias en las áreas de superficie de clavijas (mm2) con ambos dispositivos, se observaron diferencias en la formación de biomasa, donde E. coli formó una biomasa CV significativamente mayor por mm2 en las clavijas de dispositivos estándar de poliestireno que con las clavijas de tubo de PCR del dispositivo de pozo profundo (Tabla 1). P. aeruginosa formó una mayor biomasa teñida con CV / peg mm2 en comparación con los dispositivos estándar (Tabla 1). Estos hallazgos pueden resaltar las diferencias específicas de cada especie en la formación de biomasa de biopelícula en los diferentes dispositivos.

Cabe señalar que la erradicación con lejía de las biopelículas de E. coli y P. aeruginosa en dispositivos de pozos profundos se produjo a concentraciones 2-4 veces más bajas que el dispositivo estándar (Figura 4A-B, Tabla 1). Las diferencias en los valores de MBEC de lejía identificados en cada dispositivo probablemente se vean afectadas por las diferencias en las formas de las clavijas del dispositivo (las “clavijas” de pozos profundos son tubos cónicos y las clavijas estándar son cilíndricas), las diferencias de composición plástica (polipropileno versus poliestireno) y las diferencias de volumen (750 μL versus 200 μL). Por ejemplo, P. aeruginosa tenía mayor biomasa CV M / mm2 en clavijas de dispositivos de pozos profundos en comparación con dispositivos estándar, pero E. coli tenía menos biomasa en clavijas de pozos profundos (Figura 3). Esto sugiere que las concentraciones de desinfectante requeridas para la erradicación de la biopelícula pueden verse afectadas por la biomasa formada por cada especie, así como por la superficie disponible. Además, las diferencias en la forma de la clavija del dispositivo pueden influir en varias condiciones de crecimiento para especies particulares. En nuestro estudio, P. aeruginosa puede formar una mayor biomasa en clavijas de pozos profundos debido a su mayor área de superficie y aireación, ya que esta especie es un aerobio obligado en contraste con E. coli, que es un anaerobio facultativo. Hasta la fecha, no hemos identificado ningún estudio publicado que haya comparado directamente la formación de biofilm de E. coli y P. aeruginosa juntos en materiales de polipropileno27,28,29 y poliestireno30,31. Sin embargo, se han observado informes de formación robusta de biopelículas de E. coli y P. aeruginosa en estudios independientes que examinaron materiales de polipropileno o poliestireno. Con respecto a las Pseudomonads, muchas Pseudomonas spp. pueden utilizar plásticos como el polipropileno como posibles fuentes de carbono32. Por lo tanto, la disponibilidad de este dispositivo de biopelícula de pozo profundo de polipropileno es un avance útil en los estudios de biopelícula estática. El polipropileno es químicamente más duradero que el poliestireno y es un material clínicamente relevante, ya que se utiliza con frecuencia en implantes médicos, suturas y mallas para hernias o cirugías pélvicas33,34.

Aunque la biomasa de biopelícula fue formada por ambos dispositivos, el dispositivo de pozo profundo tuvo una variabilidad ligeramente mayor en la biomasa basada en el método de tinción CV y los valores de MBEC de erradicación de biopelícula OD600nm para lejía y BZK. Esto puede explicarse por 3 factores principales: 1) Los dispositivos de pozo profundo tienen una mayor área de superficie de clavija que los dispositivos estándar que estaban en ángulo en comparación con las clavijas de dispositivo estándar. 2) Ambas especies probadas pueden tener diferentes capacidades para adherirse a los materiales de polipropileno y poliestireno de cada dispositivo. 3) Los volúmenes de medios de crecimiento utilizados en cada dispositivo (pozo de 750 μL de profundidad, estándar de 200 μL) y el espaciado entre la clavija insertada y las paredes laterales del pozo difieren. Estos problemas no son un problema si solo se utiliza un tipo de dispositivo para todos los experimentos de biopelícula, sin embargo, si se seleccionan ambos dispositivos, las comparaciones que realizamos aquí deben realizarse para identificar diferencias36,37. Debido a las diferencias en el material plástico utilizado en cada dispositivo, los valores de biomasa de biopelícula teñida con CV y MBEC no deben compararse directamente entre diferentes dispositivos. Sin embargo, si los métodos y experimentos se llevan a cabo en el mismo dispositivo (pozo profundo o estándar), los resultados obtenidos para las especies y los antimicrobianos probados son comparables.

Este protocolo muestra que los dispositivos de placa de PCR de pozo profundo autoensamblados son dispositivos de biopelícula de mayor volumen para medir la formación y erradicación de biopelículas que también son rentables. Desde una perspectiva de costos, los dispositivos de biopelícula estándar con un rango de 96 tapas bien fijadas se venden al por menor a $ 29-36 dólares estadounidenses (USD) por dispositivo (Tabla de materiales). Los dispositivos de biopelícula estándar de poliestireno no son esterilizables en autoclave y son menos tolerantes a los disolventes / ácidos debido a sus propiedades químicas plásticas. Las placas de pozo profundo de polipropileno autoensambladas que se describen en este documento, equipadas con una placa de PCR (Tabla de materiales) de 96 pocillos semifalda separada cuestan un total de $ 14 USD por dispositivo ensamblado, que es la mitad del costo estándar del dispositivo de biopelícula. Cabe señalar que los precios pueden variar según la región, el distribuidor y la disponibilidad, y nuestros costos después de los descuentos institucionales llegaron a $ 9 USD / dispositivo de pozo profundo. Estos dispositivos de placa de PCR de polipropileno de pozo profundo autoensamblados tienen la ventaja adicional de ser esterilizables en autoclave para la esterilización y ofrecen 2-4 veces más biomasa de biopelícula que los dispositivos estándar.

En conclusión, este protocolo y los hallazgos representativos de las comparaciones de crecimiento de biopelículas del pozo profundo y los dispositivos de biopelícula estándar muestran que ambos dispositivos son capaces de cultivar biopelículas bacterianas, pero los dispositivos de pozo profundo forman 2-4 veces más biopelícula. El dispositivo de biopelícula de pozo profundo ofrece una alternativa viable y asequible para experimentos de formación de biopelículas de alto rendimiento de mayor volumen, como los estudios de detección de susceptibilidad a los medicamentos. Esta técnica puede generar biopelículas útiles para extracciones ‘-ómicas’ aguas abajo (proteómicas, metabolómicas, transcriptómicas) o ensayos experimentales (enzimáticos, fluorescentes) que pueden requerir mayores cantidades de materiales de biopelícula para los análisis. El dispositivo de biopelícula de pozo profundo se recomienda para laboratorios que deseen estudiar biopelículas en un ensayo de alto rendimiento de 96 pocillos utilizando materiales plásticos de menor costo, mayor volumen y químicamente duraderos que son clínicamente relevantes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por subvenciones operativas a DCB de la Subvención de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN- 2016-05891) y a MRM y GRG del programa de Subvenciones de la Iniciativa de Investigación y Desarrollo de Genómica del Gobierno de Canadá (GRDI) (GRDI7 2254557).

Materials

10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store — materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth
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Bacterial BiofilmBiofilm BiomassPCR-plate Deep Well MicroplatePeg Lid Biofilm DeviceCrystal Violet StainingAntimicrobial Susceptibility TestingMinimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC)

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Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).
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