توليد كتلة حيوية أكبر من الأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام أجهزة الصفائح الدقيقة العميقة للوحة PCR
Summary
يقدم هذا البروتوكول منهجية لإجراء نمو الأغشية الحيوية وقياسات الكتلة الحيوية باستخدام أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العميق للبئر المجمعة ذاتيا لفحص الأغشية الحيوية الثابتة ذات الغطاء المربوط جيدا بإنتاجية عالية 96 جيدا.
Abstract
يصعب القضاء على الأغشية الحيوية البكتيرية من الأسطح باستخدام التدخلات التقليدية المضادة للميكروبات. وكثيرا ما تستخدم طرق الصفائح الدقيقة عالية الإنتاجية ذات ال 96 بئرا لزراعة الأغشية الحيوية البكتيرية لاختبار القابلية السريعة لمضادات الميكروبات لحساب الحد الأدنى من قيم تركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC). تتكون أجهزة الأغشية الحيوية القياسية من أغطية مربوطة بالبوليسترين مثبتة على صفائح دقيقة من 96 بئرا وهي مثالية لقياس الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية وقيم MBEC ، ولكن هذه الأجهزة محدودة بمساحة سطح الربط المتاحة لتراكم الكتلة الحيوية والتكلفة. هنا ، نوجز بروتوكولا لاستخدام جهاز الغطاء المربوط بلوحة PCR من البولي بروبيلين المجمعة ذاتيا و 96 بئرا لزراعة الأغشية الحيوية Escherichia coli BW25113 و Pseudomonas aeruginosa PAO1. يتم وصف مقارنة بين الأغشية الحيوية على مدار 24 ساعة التي تم تشكيلها على أجهزة الآبار القياسية والعميقة من قبل كل نوع باستخدام تلطيخ الكتلة الحيوية البنفسجية البلورية واختبارات تحديد MBEC. من المتوقع أن تزيد المساحة السطحية الأكبر لأجهزة الآبار العميقة من تكوين الأغشية الحيوية الإجمالية من قبل كلا النوعين 2-4 أضعاف. شكلت P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر بكثير / mm2 على أوتاد الآبار العميقة مقارنة بالجهاز القياسي. كان لدى E. coli كتلة حيوية أكبر / mm2 على أجهزة البوليسترين القياسية مقارنة بجهاز البئر العميق. أظهرت مقايسات استئصال الأغشية الحيوية باستخدام المطهرات مثل هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض) أو كلوريد البنزالكونيوم (BZK) أن كلا المركبين يمكن أن يقأصلا الأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa من كلا الجهازين ولكن بقيم MBEC مختلفة. أدى استئصال الأغشية الحيوية BZK إلى قيم متغيرة للإشريكية القولونية MBEC بين الأجهزة ، ومع ذلك ، أظهر التبييض قيم MBEC قابلة للتكرار لكل من الأنواع والأجهزة. توفر هذه الدراسة طريقة بئر عميقة عالية الإنتاجية لزراعة كميات أكبر من الأغشية الحيوية على أجهزة البولي بروبيلين للدراسات النهائية التي تتطلب كميات أعلى من الأغشية الحيوية الثابتة.
Introduction
الزائفة الزنجارية والإشريكية القولونية هي بكتيريا بروتينية سالبة الجرام تتم دراستها عادة لقدرتها على تشكيل مجتمعات خلوية متصلة بالسطح تعرف باسم الأغشية الحيوية1. يمكن لكلا النوعين، عند نموهما كأغشية حيوية، أن يفرزا مصفوفة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) تتكون في المقام الأول من السكريات والبروتينات المختلفة، والتي يمكن أن تشمل أيضا الحمض النووي خارج الخلية و / أو الدهون، مما يوفر حماية خلوية إضافية ويعزز البقاء على قيد الحياة في البيئات القاسية والمحدودة المغذيات2،3. فسيولوجيا الأغشية الحيوية وتشكيلها من قبل كلا النوعين ذات أهمية سريرية ، لأنها تمثل مسببات الأمراض الخمسة الأولى المقاومة لمضادات الميكروبات الأكثر عزلا من دم المريض في المستشفى والتهابات المسالك البولية والرئة في كندا4,5. ومن المهم أيضا ملاحظة أن الأغشية الحيوية تشير التقديرات إلى أنها تشكل ما يقرب من 80٪ من جميع أنواع العدوى المزمنة والمتكررة التي تسببها هذه الأنواع البكتيرية6. بسبب مواد EPS المفرزة والنشاط الأيضي الأبطأ7,8 ، يصبح من الصعب القضاء على الأغشية الحيوية الراسخة عندما تتشكل على الأسطح مثل الأجهزة الطبية المزروعة والأنسجة الندبية وفي رئتي مرضى التليف الكيسي9,10 ، مما يزيد من مقاومتها لمضادات الميكروبات.
غالبا ما تجعلها خصائص النمو المتمردة للأغشية الحيوية البكتيرية أكثر مقاومة لتثبيط مضادات الميكروبات و / أو القضاء عليها2,9. وبالتالي ، فإن إنشاء طرق في المختبر لدراسة استئصال مضادات الميكروبات البيوفيلمية البكتيرية أمر بالغ الأهمية لاختيار المركبات الفعالة للقضاء على العدوى عندما تتشكل على البلاستيك الطبي (على سبيل المثال ، القسطرة الساكنة) والغرسات الطبية. تقوم أسرع طرق استزراع مضادات الميكروبات في المختبر بفحص نمو الأغشية الحيوية كثقافة بيوفيلم “ثابتة” بدلا من الثقافات “المستمرة” ، حيث يتم رصد نمو البكتيريا الثابتة في المراحل المبكرة إلى المتأخرة من تكوين الأغشية الحيوية على مدى إطار زمني قصير (24-96 ساعة) في نفس وسط النمو. تعتبر طرق الأغشية الحيوية المستمرة مرهقة للتحليل السريع لأنها تتطلب تقييم نمو الأغشية الحيوية على مدى أطر زمنية أطول نمت في غرف تسمح بالتدفق المستمر واستبدال وسائط النمو بعدد أقل من النسخ المتماثلة11. نظرا للوقت والجهد اللازمين للحفاظ على الأغشية الحيوية المستمرة وإنشائها ، فإن الأغشية الحيوية الثابتة في المختبر هي الأكثر شعبية ، حيث يتم تكييفها بسهولة لاختبارات اختبار الحساسية المضادة للميكروبات عالية الإنتاجية في ألواح ميكروتيتر بلاستيكية 96 بئرا بدلا من أنظمة غرفة التدفق المفصلة التي تحد من عدد الثقافات التي تم اختبارها في وقت واحد 12,13 . تستخدم أبسط مقايسات الصفائح الدقيقة الأغشية الحيوية الثابتة “في البئر” ألواح ميكروتيتر قياسية من البوليسترين أو الفينيل (سعة 300 ميكرولتر) لقياس تكوين الأغشية الحيوية على جانبي وقيعان كل بئر وغالبا ما تكون حلقات في واجهة السطح من الهواء إلى السطح السائل. يتم قياس تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية داخل البئر عن طريق تلطيخ الكتلة الحيوية المترسبة الملتصقة بالآبار بعد إزالة السائل متوسط النمو وغسل الأغشية الحيوية12,13. هذه الفحوصات شائعة اقتصاديا ولكن غالبا ما يكون لها مشاكل في التكاثر بسبب تصميمها المتأصل ، حيث أن الأغشية الحيوية المودعة عرضة للتلف أو الخسارة أثناء الشطف لاستعادة الخلايا وإجراءات تلطيخ الكتلة الحيوية 11,14.
للحد من خسائر البيوفيلم ، قامت أجهزة البيوفيلم التجارية القياسية بتحسين تصميمات الألواح الدقيقة البيوفيلم في البئر عن طريق إضافة غطاء بوليسترين قابل للإدخال ب 96 بئرا إلى تصميم لوحة 96 القياسي في البئر ، والذي يشار إليه باسم “جهاز البيوفيلم القياسي” هنا. تعمل إضافة غطاء مربوط على توسيع مساحة السطح المتاحة في كل بئر ميكروبليت ، مما يسمح بتعزيز التصاق السطح وتكوين الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية15,16. تسمح أجهزة الغطاء البيوفيلم المربوطة القياسية باستعادة الأغشية الحيوية وإزالتها وشطفها بشكل أكبر لاختبار قابلية الأغشية الحيوية المضادة للميكروبات اللاحقة والقضاء عليها عند إدخال أغطية مربوطة في ألواح ميكروتيتر جديدة تحتوي على تحديات في حالة الدواء أو النمو. على غرار تقنيات الألواح الدقيقة البيوفيلم في البئر ، تسمح المواد المستردة من أجهزة الغطاء المربوطة التي تمت إزالتها وغسلها باختبار بقاء الخلايا وتلطيخ الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية ، والتي تتضمن عادة تركيبات صبغة الكريستال البنفسجي (CV) 17،18،19. أجهزة الأغشية الحيوية القياسية هي أيضا الأمثل لعرض حساسية البيوفيلم المضادة للميكروبات. تراقب هذه الفحوصات تثبيط نمو الأغشية الحيوية بطريقتين: 1) عندما تضاف مضادات الميكروبات إلى الخلايا في بداية النمو ، يمكنها تحديد الحد الأدنى لقيمة تركيز تثبيط الأغشية الحيوية (MBIC). 2) عندما تتشكل الأغشية الحيوية الراسخة على الأوتاد بعد 24 ساعة ثم تتعرض لمضادات الميكروبات ، يمكنها تحديد الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) بقيمة 17,20. على غرار أجهزة الصفائح الدقيقة البيوفيلم في البئر ، فإن أجهزة الأغشية الحيوية القياسية لها بعض القيود الملحوظة ، مثل تكلفتها العالية لكل جهاز ، فهي غير قابلة للتعقيم ، وأقل متانة للمذيبات الكيميائية بسبب مادة لوحة البوليسترين المستخدمة. تحتوي أجهزة البيوفيلم القياسية أيضا على نسبة منخفضة من مساحة السطح إلى الربط ، مما يحد من الحد الأقصى لأحجام العمل في كل بئر إلى 200 ميكرولتر. هذه العوامل يمكن أن تجعل أجهزة البيوفيلم القياسية أكثر صعوبة في استخدامها للدراسات التي تتطلب كميات أكبر من البيوفيلم في شكل عالي الإنتاجية.
هنا ، نصف طريقة ثابتة ذات غطاء مربوط بالأغشية الحيوية 96 بئرا تم تطويرها في مختبرنا باستخدام ألواح البولي بروبيلين شبه المنورة المتوفرة تجاريا بسعة 0.5 مل 96 بئرا PCR المثبتة على ألواح microtiter ذات 96 بئرا لها آبار أعمق من اللوحة القياسية (جدول المواد). يبلغ الحد الأقصى لحجم عمل هذه الأجهزة المجمعة 750 ميكرولتر عند استخدامها لزراعة الأغشية الحيوية (المعروفة هنا باسم “جهاز البيوفيلم العميق للبئر”). تتمثل مزايا استخدام أجهزة الأغشية الحيوية العميقة هذه في انخفاض تكلفتها عند مقارنتها بأجهزة البيوفيلم القياسية ، ويمكن تعقيمها عن طريق التعقيم ، كما أنها تزيد من مساحة السطح لتشكيل الأغشية الحيوية على “أنبوب / أوتاد” لوحة PCR الخارجية الأكبر. باستخدام هذه الطريقة ، نعرض تطبيقات هذه الأجهزة لزراعة وتوصيف الكتلة الحيوية الأغشية الحيوية التي شكلتها الإشريكية القولونية BW25113 و P. aeruginosa PAO1. يتم وصف طرق تحديد قيم MBEC باستخدام مقايسات استئصال الأغشية الحيوية باستخدام مضادات الميكروبات المطهرة بمركب الأمونيوم الأمونيوم الرباعي (BZK) ومضادات الميكروبات هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض). تم اختيار BZK المطهر / المطهر لأن هذا المركب يستخدم بشكل متكرر لتثبيط الأغشية الحيوية من الأسطح الملوثة ، ولكن يقال إنه أقل فعالية في القضاء على الأغشية الحيوية الراسخة 21. التبييض هو مادة كيميائية فعالة للغاية للقضاء على الأغشية الحيوية المعمول بها وهو الدعامة الأساسية في التطهير الكيميائي 22. يوفر كلا المطهرين مقارنة مفيدة لقيم MBEC لكل جهاز بيوفيلم21. يتم تلخيص بروتوكول لتقييم جهاز البيوفيلم هذا باستخدام تلطيخ السيرة الذاتية واختبارات استئصال الأغشية الحيوية لتحديد MBEC في هذه المقالة. تم تضمين مخطط انسيابي للبروتوكول للحصول على نظرة عامة مبسطة لسير العمل لهذه الأساليب (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الدراسة طرق استخدام جهاز نمو الأغشية الحيوية الثابت ذي الإنتاجية العالية الأكبر حجما والبالغ 96 بئرا والذي يتضمن صفيحة دقيقة عميقة من البولي بروبيلين مزودة بغطاء صفيحة PCR شبه منفوخ لتشكيل الأغشية الحيوية (جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة; جدول المواد). قارنا الأغشية الحيوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الجهاز بجهاز البيوفيلم القياسي المتاح تجاريا من البوليسترين (جدول المواد). تستخدم طريقة جهاز البئر العميق نفس الخطوات والحلول المنهجية التي يستخدمها الجهاز القياسي17 عند الأحجام المعدلة المعدلة لأجهزة الآبار العميقة، مما يجعل هذا الجهاز مثاليا لتشكيل الأغشية الحيوية على نطاق واسع والتحليل التجريبي. تم فحص نمو E. coli BW25113 و P. aeruginosa PAO1 ، وهما نوعان سالبان الجرام معروفان بتكوين الأغشية الحيوية ، لتكوين الكتلة الحيوية وقيم MBEC المطهرة (BZK / التبييض) المستخدمة على كلا الجهازين. أظهرت مقارنة الكتلة الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية التي تشكلت على أوتاد من كل جهاز أن كلا من E. coli و P. aeruginosa شكلتا أغشية حيوية ذات كتلة حيوية أعلى على جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة عند مقارنتها بالجهاز القياسي (الشكل 3A-B). عكست الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية زيادة مساحة السطح الأكبر لأوتاد الآبار العميقة عند مقارنتها بمساحة سطح ربط الجهاز القياسية. عندما أخذنا في الاعتبار الاختلافات في مناطق سطح الربط (mm2) مع كلا الجهازين ، لوحظت اختلافات في تكوين الكتلة الحيوية ، حيث شكلت E. coli كتلة حيوية CV أكبر بكثير لكل mm2 على أوتاد الجهاز القياسية البوليسترين مقارنة بأوتاد أنبوب PCR لجهاز البئر العميق (الجدول 1). شكلت P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر ملطخة بالسيرة الذاتية / ربط mm2 مقارنة بالأجهزة القياسية (الجدول 1). قد تسلط هذه النتائج الضوء على الاختلافات الخاصة بالأنواع في تكوين الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية على الأجهزة المختلفة.
وتجدر الإشارة إلى أن استئصال المبيضات للأغشية الحيوية للإشريكية القولونية والمتصورة الزنجارية على أجهزة الآبار العميقة حدث بتركيزات أقل بمقدار 2-4 أضعاف من الجهاز القياسي (الشكل 4A-B، الجدول 1). من المحتمل أن تتأثر الاختلافات في قيم MBEC المبيضة المحددة من كل جهاز بالاختلافات في أشكال ربط الجهاز (“أوتاد” الآبار العميقة هي أنابيب مدببة والأوتاد القياسية أسطوانية) ، واختلافات التركيب البلاستيكي (البولي بروبيلين مقابل البوليسترين) ، والاختلافات في الحجم (750 ميكرولتر مقابل 200 ميكرولتر). على سبيل المثال، كان لدى P. aeruginosa كتلة حيوية CV M أكبر / mm2 على أوتاد أجهزة الآبار العميقة عند مقارنتها بالأجهزة القياسية ، ولكن E. coli كان لديه كتلة حيوية أقل على أوتاد الآبار العميقة (الشكل 3). وهذا يشير إلى أن تركيزات المطهرات اللازمة للقضاء على الأغشية الحيوية قد تتأثر بالكتلة الحيوية التي يشكلها كل نوع وكذلك المساحة السطحية المتاحة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر الاختلافات في شكل ربط الجهاز على ظروف النمو المختلفة لأنواع معينة. في دراستنا ، قد تشكل P. aeruginosa كتلة حيوية أكبر على أوتاد الآبار العميقة بسبب مساحة سطحها الأكبر وتهويتها ، لأن هذا النوع هو هوائي ملزم على النقيض من الإشريكية القولونية ، وهو لاهوائي اختياري. حتى الآن ، لم نحدد أي دراسات منشورة قارنت مباشرة تكوين الأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa معا على كل من مواد البولي بروبيلين 27،28،29 والبوليسترين 30،31. ومع ذلك ، فقد لوحظت تقارير عن تكوين قوي للأغشية الحيوية E. coli و P. aeruginosa في دراسات مستقلة تدرس إما مواد البولي بروبيلين أو البوليسترين. فيما يتعلق بالزائفة ، يمكن للعديد من Pseudomonas spp. استخدام البلاستيك مثل البولي بروبيلين كمصادر محتملة للكربون 32. وبالتالي ، فإن توافر جهاز الأغشية الحيوية العميقة للبئر من البولي بروبيلين هو تقدم مفيد في دراسات الأغشية الحيوية الثابتة. البولي بروبيلين أكثر متانة كيميائيا من البوليسترين وهو مادة ذات صلة سريريا ، حيث يتم استخدامه بشكل متكرر في الغرسات الطبية والغرز والشبكات لجراحات الفتق أو الحوض33,34.
على الرغم من أن الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية تشكلت بواسطة كلا الجهازين ، إلا أن جهاز البئر العميق كان له تباين أعلى قليلا في الكتلة الحيوية استنادا إلى طريقة تلطيخ السيرة الذاتية وقيم MBEC لاستئصال الأغشية الحيوية OD600nm للتبييض و BZK. يمكن تفسير ذلك من خلال 3 عوامل رئيسية: 1) أجهزة الآبار العميقة لديها مساحة سطح ربط أكبر من الأجهزة القياسية التي كانت بزاوية مقارنة بأوتاد الأجهزة القياسية. 2) قد يكون لكلا النوعين اللذين تم اختبارهما قدرات مختلفة على الالتصاق بمواد البولي بروبلين والبوليسترين لكل جهاز. 3) تختلف أحجام وسائط النمو المستخدمة في كل جهاز (750 ميكرولتر عمق البئر ، 200 ميكرولتر قياسي) والتباعد بين الوتد المدرج إلى الجدران الجانبية للبئر. هذه المشكلات ليست مشكلة إذا تم استخدام نوع واحد فقط من الأجهزة لجميع تجارب البيوفيلم ، ومع ذلك ، إذا تم اختيار كلا الجهازين ، فيجب إجراء المقارنات التي أجريناها هنا لتحديد الاختلافات36,37. نظرا للاختلافات في المواد البلاستيكية المستخدمة في كل جهاز ، لا ينبغي مقارنة الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية الملطخة بالسيرة الذاتية وقيم MBEC مباشرة بين الأجهزة المختلفة. ومع ذلك ، إذا أجريت الطرق والتجارب على نفس الجهاز (بئر عميق أو قياسي) ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها للأنواع ومضادات الميكروبات التي تم اختبارها قابلة للمقارنة.
يوضح هذا البروتوكول أن أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العميقة المجمعة ذاتيا هي جهاز بيوفيلم أكبر حجما لقياس تكوين الأغشية الحيوية والقضاء عليها وهو أيضا فعال من حيث التكلفة. من منظور التكلفة ، تتراوح أجهزة البيوفيلم القياسية ذات الأغطية المثبتة جيدا 96 بسعر يتراوح بين 29 و 36 دولارا أمريكيا لكل جهاز (جدول المواد). أجهزة البيوفيلم القياسية من البوليسترين ليست قابلة للتعقيم وهي أقل تحملا للمذيبات / الأحماض بسبب خصائصها الكيميائية البلاستيكية. تكلف ألواح الآبار العميقة المصنوعة من البولي بروبيلين ذاتية التجميع الموضحة هنا ، والمزودة بلوحة PCR منفصلة شبه منحرفة من 96 بئرا (جدول المواد) ما مجموعه 14 دولارا أمريكيا لكل جهاز مجمع ، وهو نصف تكلفة جهاز البيوفيلم القياسية. تجدر الإشارة إلى أن الأسعار قد تختلف اعتمادا على المنطقة والموزع والتوافر ، وتكاليفنا بعد الخصومات المؤسسية عملت إلى 9 دولارات أمريكية / جهاز البئر العميق. تتمتع هذه الأجهزة المصنوعة من البولي بروبيلين متعدد الكلور PCR المجمعة ذاتيا بميزة إضافية تتمثل في كونها قابلة للتعقيم للتعقيم وتوفر كتلة حيوية للأغشية الحيوية 2-4 مرات أكثر من الأجهزة القياسية.
في الختام ، يظهر هذا البروتوكول والنتائج التمثيلية من مقارنات نمو الأغشية الحيوية للبئر العميق وأجهزة الأغشية الحيوية القياسية أن كلا الجهازين قادران على زراعة الأغشية الحيوية البكتيرية ، لكن أجهزة الآبار العميقة تشكل 2-4 أضعاف البيوفيلم. يوفر جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة بديلا قابلا للتطبيق وبأسعار معقولة لتجارب تكوين الأغشية الحيوية ذات الإنتاجية الكبيرة مثل دراسات فحص قابلية الأدوية. قد تولد هذه التقنية أغشية حيوية مفيدة لاستخراج “-omics” في المراحل النهائية (البروتيوميك ، الأيض ، النسخ) أو المقايسات التجريبية (الأنزيمية ، الفلورسنت) التي قد تتطلب كميات أكبر من مواد الأغشية الحيوية للتحليلات. يوصى باستخدام جهاز الأغشية الحيوية للبئر العميقة للمختبرات التي ترغب في دراسة الأغشية الحيوية في فحص 96 بئرا عالي الإنتاجية باستخدام مواد بلاستيكية أقل تكلفة وأكبر حجما ومتينة كيميائيا ذات صلة سريريا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا العمل من خلال منح التشغيل إلى DCB من منحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN- 2016-05891) وإلى MRM و GRG من برنامج منحة الحكومة الكندية للبحث والتطوير في علم الجينوم (GRDI) (GRDI7 2254557).
Materials
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | — | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
References
- Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
- Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
- Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, 22-31 (2019).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
- Flemming, H. -. C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
- Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, (2005).
- Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
- O’Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
- vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
- Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
- Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
- Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
- Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
- Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
- Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
- El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
- Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
- Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
- Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
- Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
- Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
- Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
- Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020)
- Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
- . Crystal violet Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017)
