Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

El trastorno intrínseco (DI) describe proteínas (IDP) o regiones dentro de las proteínas (IDR) que no se pliegan espontáneamente en estructuras secundarias o terciarias estables, sino que son biológicamente activas. En general, la función de los IDP/IDR es facilitar interacciones específicas pero reversibles con biomoléculas en condiciones fisiológicas¹. Por lo tanto, las IDP y las IDR están involucradas en una variedad de funciones celulares, incluido el reclutamiento, la organización y la estabilización de complejos multiproteicos, por ejemplo, el ensamblaje y la actividad del espliceosoma², el reclutamiento y la organización de componentes en los sitios de daño del ADN³, la organización y estabilización del reclutamiento de complejos de transcripción⁴ o del remodelador de cromatina BAF⁵. Además, los IDP se encuentran en nexos de señalización donde su promiscuidad para diferentes socios de unión les permite mediar en la transferencia de información a través de redes de proteínas celulares⁶. Trabajos recientes también han revelado una propensión de las regiones IDR a autoasociarse formando condensados biomoleculares a través del proceso de separación de fases líquido-líquido⁷. Muchas de las funciones mencionadas anteriormente que involucran el DI también se cree que involucran algún aspecto de la formación de condensado⁸. A pesar de la importancia de la identificación para el ensamblaje de complejos biomoleculares, la estabilización, el andamiaje y la transducción de señales, los detalles atómicos de sus interacciones específicas son difíciles de identificar, ya que las IDP y las IDR no suelen ser susceptibles de investigaciones estructurales mediante cristalografía de rayos X o microscopía electrónica criogénica.

La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica ideal para investigar el DI, ya que no depende de la presencia de conjuntos estructurales rígidos u homogéneos, sino que informa sobre el entorno local inmediato de los núcleos individuales. La frecuencia de resonancia, o cambio químico, de un núcleo en una molécula dada está influenciada por campos magnéticos débiles inducidos por la distribución electrónica local, que a su vez depende de las longitudes de enlace, los ángulos, la proximidad de otros núcleos, las interacciones con los socios de unión y^{otros factores.} Por lo tanto, cada núcleo actúa como una sonda estructural única y específica del sitio sensible a los cambios en su entorno químico local. A pesar de estas ventajas, la RMN es una técnica a granel, y el cambio químico observado es el promedio de todos los ambientes muestreados por un núcleo en particular. Se han desarrollado una serie de técnicas de RMN, muchas de las cuales se describen en este número, para recuperar información estructural, dinámica y cinética sobre conformaciones biomoleculares de alta energía y poco pobladas contenidas en el desplazamiento químico promedio^10,11. Aunque transitoriamente poblados, la identificación y cuantificación de estos estados son importantes para determinar los detalles de los mecanismos funcionales¹². Por ejemplo, en el caso de IDPs e IDRs, el conjunto conformacional puede estar sesgado para muestrear preferentemente conformaciones que son productivas para la formación de complejos de encuentro con compañeros de unión fisiológicos. La detección de estos estados, así como la identificación de las interacciones y dinámicas inter e intramoleculares específicas del residuo, son importantes para determinar los mecanismos estructurales subyacentes de la función de las proteínas y la formación de complejos.

Se describe un protocolo para el uso de la RMN de mejora de la relajación paramagnética (PRE) para investigar estados transitorios poco poblados importantes para la formación de complejos biomoleculares mediados por IDP/IDR¹³. Este enfoque es útil para estudiar las interacciones transitorias proteína-proteína, como las que promueven el ensamblaje de fibrillas amiloides a partir de la α-sinucleína 14,15 o la autoasociación de FUS¹⁶, así como para caracterizar interacciones proteína-proteínas específicas^, como entre proteínas de señalización¹⁷. Se presenta un ejemplo de un IDP autoasociado, en el que las interacciones inter e intramoleculares específicas dan lugar a estados preferentemente compactados, así como a interacciones específicas del sitio que impulsan la autoasociación.

El PRE surge de la interacción dipolar magnética de un núcleo a un centro paramagnético con un tensor g isótropo, comúnmente suministrado en forma de un electrón desapareado en un grupo nitrógeno o como un átomo metálico paramagnético¹⁸ (Figura 1). Mientras que los átomos con tensores g anisotrópicos también producen un efecto PRE, el análisis de estos sistemas es más difícil debido a los efectos de confusión aportados por los desplazamientos de pseudocontacto (PCS) o el acoplamiento dipolar residual (RDC)^13,19. La fuerza de la interacción entre un núcleo y el centro paramagnético depende de la distancia <^r-6> entre los dos. Esta interacción da como resultado un aumento en las tasas de relajación nuclear, lo que provoca un ensanchamiento de la línea detectable incluso para interacciones de largo alcance (~10-35 Å), porque el momento magnético del electrón desapareado es muy fuerte^20,21. La detección de estados transitorios con el PRE es posible si se cumplen las dos condiciones siguientes; (1) la interacción transitoria está en intercambio rápido en la escala de tiempo de RMN (el desplazamiento químico observado es un promedio ponderado por población de los estados de intercambio); y (2) la distancia entre los núcleos y el centro paramagnético es más corta en el estado transitoriamente poblado que en el estado principal¹¹. El PRE transversal se denota Γ₂ y, a efectos prácticos, se calcula a partir de la diferencia en las tasas de relajación transversal de ¹H entre una muestra que contiene un centro paramagnético y un control diamagnético. Para un tratamiento en profundidad de la teoría del PRE y los cambios de pseudocontacto relacionados en regímenes de intercambio rápido y lento, se remite al lector a las revisiones exhaustivas de Clore y colaboradores^13,22. Aquí, solo se considera la situación en la que ¹H _{N-Γ 2} se encuentra en el régimen de intercambio rápido, donde debido a la dependencia ^r-6 del PRE, la tasa de relajación observada está relacionada tanto con la distancia a la que el centro paramagnético se acerca al núcleo como con la cantidad de tiempo que pasa en esa conformación. Por lo tanto, las conformaciones transitorias que no implican un acercamiento cercano producen un PRE pequeño, mientras que las interacciones más cercanas, incluso si son de corta duración, producirán un PRE más grande.

En el caso de los PDI, el PRE se utiliza para medir y diferenciar las interacciones que se producen dentro de una sola molécula (intramolecular) y entre moléculas separadas (intermolecular). Al unir un centro paramagnético a una proteína visible de RMN (p. ej., marcada con ¹⁵N) o invisible de RMN (p. ej., abundancia natural ^{de 14}N), se puede determinar la fuente (inter o intramolecular) del PRE (Figura 2). La mutagénesis dirigida al sitio que introduce un residuo de cisteína es un enfoque conveniente para unir un centro paramagnético (etiqueta de espín) a una proteína²³. Se han propuesto varios tipos de moléculas para su uso como etiquetas de espín, incluyendo la quelación de metales (basada en EDTA) y la de radicales libres (basada en nitrógeno)²⁴. Se han descrito varias etiquetas de centrifugado de nitrógeno y están disponibles con diferentes químicas reactivas a la cisteína, como metanetiosulfonato, maleimida y yodoacetamida^25,26 (Figura 1). La flexibilidad inherente de la etiqueta o del enlazador puede ser problemática para ciertos análisis y, en estas situaciones, se han propuesto diferentes estrategias para limitar el movimiento de la marca, como la adición de grupos químicos voluminosos o el uso de un segundo enlazador para anclar la etiqueta a la proteína (unión de dos sitios)^{27, Artículo 28}. Además, las etiquetas disponibles comercialmente pueden contener proteínas diastereoméricas, pero generalmente esto no contribuirá a la PRE²⁹ observada. Se describe el uso del 3-Maleimido-PROXYL unido a una cisteína libre a través de la química de la maleimida, ya que está fácilmente disponible, es rentable, no reversible y el agente reductor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se puede mantener en la solución durante toda la reacción de marcado. Dado que el 3-maleimido-proxyl tiene un tensor g isotrópico, no se inducen PCS ni RDC, y se pueden utilizar las mismas asignaciones de desplazamiento químico tanto para las muestras paramagnéticas como para las diamagnéticas¹³.

El ¹H_{N-T 2} se mide utilizando una estrategia de dos puntos de tiempo (T a, T_b) que previamente ha demostrado ser tan precisa como la recopilación de una serie de evolución completa que consta de 8 _a 12 puntos de tiempo³⁰. El primer punto de tiempo (T a) se establece lo más cerca posible de cero, y la longitud óptima del segundo punto de tiempo depende de la magnitud del mayor PRE esperado para una muestra dada y se puede estimar _a partir de: T_b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) donde R _2,dia representa el R ₂ de la muestra diamagnética¹³. Si se desconoce la magnitud de los PRE más grandes, establecer T _b en ~ una ^{vez 1 H}T 2 de la proteína es una buena estimación inicial y optimizarse aún más ajustando T₂ para mejorar la señal a ruido. Esta estrategia de medición de dos puntos reduce significativamente el tiempo experimental requerido para medir los PRE y permite tiempo para un mayor promedio de señales, particularmente porque se utilizan muestras relativamente diluidas para minimizar los efectos de los contactos no específicos entre moléculas. Para medir ¹H,_N-T, 2 se utiliza una secuencia de impulsos basada en HSQC _{y se} ha descrito en detalle en otro lugar³⁰. Para mejorar la sensibilidad, los pulsos duros de las transferencias INEPT hacia adelante y hacia atrás pueden reemplazarse con pulsos con forma; alternativamente, la secuencia se convierte fácilmente en una lectura³¹ basada en TROSY. Dado que las IDP suelen tener tasas de relajación transversal mucho más largas, lo que da lugar a anchos de línea más estrechos (debido al desorden inherente) que las proteínas globulares de tamaño similar, se pueden utilizar tiempos de adquisición largos en la dimensión indirecta para mejorar la resolución espectral y aliviar la limitación de dispersión por desplazamiento químico inherente a las IDP.

PRE es una herramienta útil para estudiar las interacciones proteína-proteína y proteína-ácido nucleico, en particular las interacciones que son transitorias o poco pobladas. Se proporciona un protocolo detallado para la preparación de una muestra de RMN adecuada para medir los PRE, incluidos los pasos para la purificación de proteínas, el etiquetado de espín dirigido al sitio, la configuración y calibración del programa de pulsos, el procesamiento y la interpretación de los datos de RMN. A lo largo de todo el estudio se señalan importantes consideraciones experimentales que pueden afectar a la calidad de los datos y al resultado experimental, como la concentración de la muestra, la selección de la etiqueta de espín y la eliminación de los componentes paramagnéticos.