Усиление парамагнитной релаксации для обнаружения и характеристики самоассоциаций внутренне неупорядоченных белков

Внутреннее расстройство (ID) описывает белки (IDP) или области внутри белков (IDR), которые не спонтанно сворачиваются в стабильные вторичные или третичные структуры, но являются биологически активными. Как правило, функция IDP/IDR заключается в содействии специфическим, но обратимым взаимодействиям с биомолекулами в физиологических^{условиях1}. Таким образом, IDP и IDR участвуют в ряде клеточных функций, включая рекрутирование, организацию и стабилизацию мультибелковых комплексов, например, сборку и активность сплайсосомы², рекрутирование и организацию компонентов в сайтах повреждения ДНК³, организацию и стабилизацию рекрутирования транскрипционных комплексов⁴ или хроматинового ремоделера BAF⁵. Кроме того, IDP обнаруживаются в сигнальных нексусах, где их беспорядочные связи с различными партнерами по связыванию позволяют им опосредуть передачу информации через клеточные белковые^сети. Недавние работы также выявили склонность областей IDR к самоассоциированию, образуя биомолекулярные конденсаты в процессе разделения фаз жидкость-жидкость⁷. В настоящее время считается, что многие из вышеупомянутых функций, связанных с ИД, также включают в себя некоторый аспект образования конденсата⁸. Несмотря на важность ИД для сборки, стабилизации, скаффолдинга и передачи сигналов биомолекулярных комплексов, атомные детали их специфических взаимодействий трудно идентифицировать, поскольку IDP и IDR обычно не поддаются структурным исследованиям с использованием рентгеновской кристаллографии или криогенной электронной микроскопии.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) является идеальным методом для исследования ИД, поскольку он не зависит от наличия жестких или однородных структурных ансамблей, а сообщает о непосредственном локальном окружении отдельных ядер. Резонансная частота, или химический сдвиг, ядра в данной молекуле зависит от слабых магнитных полей, индуцированных локальным распределением электронов, которое, в свою очередь, зависит от длины связи, углов, близости других ядер, взаимодействия с партнерами по связыванию и^{других факторов.} Таким образом, каждое ядро действует как уникальный, сайт-специфичный структурный зонд, чувствительный к изменениям в своей локальной химической среде. Несмотря на эти преимущества, ЯМР является массовым методом, и наблюдаемый химический сдвиг является средним значением для всех сред, отобранных конкретным ядром. Был разработан ряд методов ЯМР, многие из которых описаны в этом выпуске, для восстановления структурной, динамической и кинетической информации о высокоэнергетических, малонаселенных биомолекулярных конформациях, содержащихся в усредненном химическом сдвиге^10,11. Несмотря на то, что эти состояния временно заселены, их идентификация и количественная оценка важны для определения деталей функциональных механизмов¹². Например, в случае IDP и IDR конформационный ансамбль может быть смещен в сторону преимущественного отбора конформаций, продуктивных для формирования комплексов встреч с физиологическими партнерами по связыванию. Обнаружение этих состояний, а также идентификация меж- и внутримолекулярных взаимодействий и динамики, специфичных для остатков, важны для определения основных структурных механизмов функционирования белков и образования комплексов.

Описан протокол использования ЯМР с усилением парамагнитной релаксации (PRE) для исследования переходных, малонаселенных состояний, важных для формирования IDP/IDR-опосредованных биомолекулярных комплексов¹³. Этот подход полезен для изучения транзиторных белок-белковых взаимодействий, таких как те, которые способствуют сборке амилоидных фибрилл из α-синуклеина 14,15 или самоассоциации FUS¹⁶, а также для характеристики специфических белок-белковых взаимодействий^, таких как между сигнальными белками¹⁷. Представлен пример самоассоциативного IDP, в котором специфические меж- и внутримолекулярные взаимодействия приводят к преимущественно компактным состояниям, а также сайт-специфичным взаимодействиям, которые управляют самоассоциацией.

PRE возникает в результате магнитного дипольного взаимодействия ядра с парамагнитным центром с изотропным g-тензором, обычно поставляемым в виде неспаренного электрона на нитроксидной группе или в виде парамагнитного атома металла¹⁸ (рис. 1). В то время как атомы с анизотропными g-тензорами также производят эффект PRE, анализ этих систем более сложен из-за искажающих эффектов, вносимых псевдоконтактными сдвигами (PCS) или остаточной дипольной связью (RDC)^13,19. Сила взаимодействия между ядром и парамагнитным центром зависит от расстояния <^r-6> между ними. Это взаимодействие приводит к увеличению скоростей ядерной релаксации, что приводит к обнаруживаемому уширению линии даже для дальних взаимодействий (~10-35 Å), поскольку магнитный момент неспаренного электрона очень силен^20,21. Детектирование переходных состояний с помощью PRE возможно при соблюдении следующих двух условий; (1) переходное взаимодействие происходит в быстром обмене на временной шкале ЯМР (наблюдаемый химический сдвиг представляет собой средневзвешенное по популяции значение состояний обмена); и (2) расстояние между ядрами и парамагнитным центром короче в переходно-населенном состоянии, чем в основном состоянии¹¹. Поперечная ПЭ обозначается Γ₂ и для практических целей вычисляется по разности скоростей поперечной релаксации ^{в 1}Н между образцом, содержащим парамагнитный центр, и диамагнитным регулятором. Для углубленного рассмотрения теории PRE и связанных с ней псевдоконтактных сдвигов в режимах быстрого и медленного обмена читатель может обратиться к подробным обзорам Клора и его коллег^13,22. Здесь рассматривается только ситуация, когда ¹H N-Γ₂ находится в режиме быстрого обмена, где ^{из-за r-6-зависимости} PRE наблюдаемая скорость релаксации связана как с расстоянием, на которое парамагнитный центр приближается к ядру, так и с количеством времени, которое он проводит в этой конформации. Таким образом, переходные конформации, не предполагающие близкого сближения, приводят к малому PRE, в то время как более тесные взаимодействия, даже если они кратковременны, приведут к большему PRE.

Для IDP PRE используется для измерения и дифференциации взаимодействий, происходящих внутри одной молекулы (внутримолекулярное) и между отдельными молекулами (межмолекулярное). Прикрепив парамагнитный центр к видимому (например, ¹⁵N-меченному) или невидимому (например, природному изобилию ¹⁴N) белку, можно определить источник (меж- или внутримолекулярный) PRE (рис. 2). Сайт-направленный мутагенез, при котором вводится остаток цистеина, является удобным подходом для присоединения парамагнитного центра (спин-метки) к белку²³. Несколько типов молекул были предложены для использования в качестве спиновых меток, в том числе хелатирующие (на основе ЭДТА) и свободнорадикальные (на основе нитроксида)²⁴. Были описаны различные спиновые метки нитроксида, которые доступны с различными химически активными химическими веществами, такими как метанетиосульфонат, малеимид и йодоацетамид^25,26 (рис. 1). Гибкость, присущая метке или линкеру, может быть проблематичной для некоторых анализов, и в этих ситуациях были предложены различные стратегии для ограничения движения метки, такие как добавление громоздких химических групп или использование второго линкера для привязки метки к белку (прикрепление двух сайтов)^{27. 28}. См. Кроме того, коммерчески доступные метки могут содержать диастереомерные белки, но, как правило, это не способствует наблюдаемому PRE²⁹. Описано использование 3-Малеймидо-ПРОКСИЛА, присоединенного к свободному цистеину с помощью химии малеимида, поскольку он легко доступен, экономически эффективен, необратим, а восстановитель трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТЦЭП) может сохраняться в растворе на протяжении всей реакции мечения. Поскольку 3-Малеймидо-ПРОКСИЛ имеет изотропный g-тензор, ПКС или РДК не индуцируются, и одни и те же назначения химического сдвига могут быть использованы как для парамагнитных, так и для диамагнитных образцов¹³.

¹H_{N-T 2} измеряется с использованием стратегии двух временных точек (T _a, T_b), которая, как было показано ранее, столь же точна, как и сбор полного ряда эволюции, состоящего из 8-12 временных точек³⁰. Первая временная точка (T _a) устанавливается как можно ближе к нулю, а оптимальная длина второй временной точки зависит от величины наибольшего ожидаемого PRE для данного образца и может быть оценена по формуле: T_b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2), где R _2,dia представляет R ₂ диамагнитного образца¹³. Если величина наибольших PRE неизвестна, установка T_b в ~ 1 раз больше ¹H T2 белка является хорошей начальной оценкой и в дальнейшем оптимизируется путем корректировки _T2 для улучшения соотношения сигнал/шум. Эта двухточечная стратегия измерения значительно сокращает экспериментальное время, необходимое для измерения PRE, и дает время для большего усреднения сигнала, особенно с учетом того, что для минимизации эффектов неспецифических контактов между молекулами используются относительно разбавленные образцы. Последовательность импульсов на основе HSQC используется для измерения ¹H N-T₂ и была подробно описана в другом месте³⁰. Для повышения чувствительности жесткие импульсы прямой и обратной передач INEPT могут быть заменены фигурными импульсами; в качестве альтернативы последовательность легко преобразуется в считывание на основе TROSY³¹. Поскольку IDP, как правило, имеют гораздо более длительную скорость поперечной релаксации, что приводит к более узкой ширине линии (из-за присущего им беспорядка), чем глобулярные белки аналогичного размера, длительное время регистрации в косвенном измерении может быть использовано для улучшения спектрального разрешения и смягчения ограничения дисперсии химического сдвига, присущего IDP.

PRE является полезным инструментом для изучения белок-белковых и белок-нуклеиновых кислот, особенно переходных или малонаселенных. Представлен подробный протокол подготовки образца ЯМР, пригодного для измерения ПРЭ, включая этапы очистки белка, сайт-ориентированного спинового мечения, настройки и калибровки импульсной программы, обработки и интерпретации данных ЯМР. В работе отмечаются важные экспериментальные соображения, которые могут повлиять на качество данных и исход эксперимента, включая концентрацию образца, выбор спиновой метки и удаление парамагнитных компонентов.