Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

A desordem intrínseca (DI) descreve proteínas (IDPs) ou regiões dentro de proteínas (IDRs) que não se dobram espontaneamente em estruturas secundárias ou terciárias estáveis, mas são biologicamente ativas. Geralmente, a função das IDPs/IDRs é facilitar interações específicas, porém reversíveis, com biomoléculas em condições fisiológicas¹. Assim, IDPs e IDRs estão envolvidas em uma variedade de funções celulares, incluindo recrutamento, organização e estabilização de complexos multiproteicos, por exemplo, a montagem e atividade do spliceossomo², recrutamento e organização de componentes em locais de dano ao DNA³, organização e estabilização do recrutamento de complexos de transcrição⁴, ou do remodelador de cromatina BAF⁵. Além disso, os IDPs são encontrados em nexos de sinalização, onde sua promiscuidade para diferentes parceiros de ligação lhes permite mediar a transferência de informações através de redes de proteínas celulares⁶. Trabalhos recentes também revelaram uma propensão para regiões IDR se auto-associarem formando condensados biomoleculares através do processo de separação de fases líquido-líquido⁷. Acredita-se que muitas das funções acima mencionadas envolvendo ID também envolvam algum aspecto da formação do condensado⁸. Apesar da importância do ID para montagem de complexos biomoleculares, estabilização, andaimes e transdução de sinal, os detalhes atômicos de suas interações específicas são difíceis de identificar, uma vez que IDPs e IDRs normalmente não são passíveis de investigações estruturais usando cristalografia de raios X ou microscopia eletrônica criogênica.

A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica ideal para investigar a DI, pois não depende da presença de conjuntos estruturais rígidos ou homogêneos, mas relata o ambiente local imediato de núcleos individuais. A frequência de ressonância, ou deslocamento químico, de um núcleo em uma dada molécula é influenciada por campos magnéticos fracos induzidos pela distribuição eletrônica local, que por sua vez é dependente de comprimentos de ligação, ângulos, proximidade de outros núcleos, interações com parceiros de ligação e outros fatores⁹. Assim, cada núcleo atua como uma sonda estrutural única, sítio-específica, sensível a mudanças em seu ambiente químico local. Apesar dessas vantagens, a RMN é uma técnica de massa, e o deslocamento químico observado é a média de todos os ambientes amostrados por um determinado núcleo. Uma série de técnicas de RMN, muitas das quais são descritas neste número, foi desenvolvida para recuperar informações estruturais, dinâmicas e cinéticas sobre conformações biomoleculares de alta energia e baixa densidade populacional contidas no deslocamento químico médio^10,11. Embora transitoriamente povoados, a identificação e quantificação desses estados são importantes para determinar os detalhes dos mecanismos funcionais¹². Por exemplo, no caso de IDPs e IDRs, o conjunto conformacional pode ser enviesado para amostras preferenciais de conformações que são produtivas para a formação de complexos de encontro com parceiros de ligação fisiológicos. A detecção desses estados, bem como a identificação das interações e dinâmicas inter e intramoleculares específicas do resíduo, são importantes para determinar os mecanismos estruturais subjacentes da função proteica e da formação de complexos.

Um protocolo para o uso de RMN de realce de relaxação paramagnética (PRE) para investigar estados transitórios e pouco povoados importantes para a formação de complexos biomoleculares mediados por IDP/IDR é descrito¹³. Essa abordagem é útil para estudar as interações proteína-proteína transitórias, como as que promovem a montagem de fibrilas amiloides a partir da α-sinucleína 14,15 ou a autoassociação de USF¹⁶, bem como para caracterizar interações proteína-proteína específicas^, como entre proteínas sinalizadoras¹⁷. Um exemplo de PDI auto-associado é apresentado, onde interações inter e intramoleculares específicas resultam em estados preferencialmente compactados, bem como interações sítio-específicas que impulsionam a auto-associação.

O PRE surge da interação dipolar magnética de um núcleo a um centro paramagnético com um tensor g isotrópico, comumente fornecido na forma de um elétron não pareado em um grupo de nitróxidos ou como um átomo de metal paramagnético¹⁸ (Figura 1). Enquanto átomos com tensores g anisotrópicos também produzem um efeito PRE, a análise desses sistemas é mais difícil devido aos efeitos de confusão contribuídos pelos deslocamentos de pseudocontato (PCS) ou acoplamento dipolar residual (RDC)^13,19. A força da interação entre um núcleo e o centro paramagnético é dependente da distância <^r-6> entre os dois. Essa interação resulta em um aumento nas taxas de relaxação nuclear, o que causa um alargamento detectável da linha mesmo para interações de longo alcance (~10-35 Å), porque o momento magnético do elétron não pareado é muito forte^20,21. A detecção de estados transitórios com o PRE é possível se as duas condições seguintes forem atendidas; (1) a interação transitória está em troca rápida na escala de tempo de RMN (o deslocamento químico observado é uma média ponderada pela população dos estados de troca); e (2) a distância núcleos/centro paramagnético é menor no estado transitoriamente povoado do que no estado^maior11. O PRE transversal é indicado Γ₂ e, para fins práticos, é calculado a partir da diferença nas taxas de relaxação transversal de ¹H entre uma amostra contendo um centro paramagnético e um controle diamagnético. Para um tratamento aprofundado da teoria da PRE e dos respectivos deslocamentos de pseudocontato em regimes de troca rápida e lenta, remete-se o leitor às revisões abrangentes de Clore e colaboradores ^13,22. Aqui, considera-se apenas a situação em que ¹H N-Γ₂ está no regime de troca rápida, onde devido à dependência ^r-6 do PRE, a taxa de relaxamento observada está relacionada tanto com a distância a que o centro paramagnético se aproxima do núcleo quanto com a quantidade de tempo que ele gasta nessa conformação. Portanto, conformações transitórias que não envolvem uma abordagem próxima produzem um PRE pequeno, enquanto interações mais próximas, mesmo que de curta duração, produzirão um PRE maior.

Para IDPs, o PRE é usado para medir e diferenciar as interações que ocorrem dentro de uma única molécula (intramolecular) e entre moléculas separadas (intermolecular). Ao anexar um centro paramagnético a uma proteína de RMN visível (por exemplo, ^{marcada com 15}N) ou invisível de RMN (por exemplo, abundância natural ^{de 14}N), a fonte (inter ou intramolecular) do PRE pode ser determinada (Figura 2). A mutagênese sítio-dirigida que introduz um resíduo de cisteína é uma abordagem conveniente para anexar um centro paramagnético (spin-label) a uma proteína²³. Vários tipos de moléculas têm sido propostos para uso como spin labels, incluindo quelantes de metais (à base de EDTA) e radicais livres (à base de nitróxido)²⁴. Vários marcadores de spin de nitroóxido foram descritos e estão disponíveis com diferentes químicas reativas à cisteína, como metanetiossulfonato, maleimida e iodoacetamida^25,26 (Figura 1). A flexibilidade inerente do tag ou do linker pode ser problemática para certas análises e, nessas situações, diferentes estratégias têm sido propostas para limitar o movimento do tag, como a adição de grupos químicos volumosos ou o uso de um segundo ligante para ancorar o tag à proteína (dois locais de fixação)^{27, 28º}. Além disso, etiquetas comercialmente disponíveis podem conter proteínas diastereoméricas, mas geralmente isso não contribuirá para a PRE observada²⁹. O uso do 3-Maleimido-PROXYL ligado a uma cisteína livre via química da maleimida é descrito por ser prontamente disponível, custo-efetivo, não reversível, e o agente redutor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) pode ser mantido na solução durante toda a reação de marcação. Como o 3-Maleimido-PROXYL possui um tensor g isotrópico, nenhum PCS ou RDCs é induzido, e as mesmas atribuições de deslocamento químico podem ser usadas tanto para as amostras paramagnéticas quanto diamagnéticas¹³.

O ¹H_{N-T 2} é medido usando uma estratégia de dois pontos de tempo (T a, T_b) que já se mostrou tão precisa quanto coletar uma série completa de evolução consistindo de 8 _a 12 pontos de tempo³⁰. O primeiro ponto de tempo (T a) é definido tão próximo de zero quanto possível, e o comprimento ótimo do segundo ponto de tempo é dependente da magnitude do maior PRE esperado para uma dada amostra e pode ser estimado _a partir de: T_b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) onde R _2,dia representa o R ₂ da amostra diamagnética¹³. Se a magnitude dos maiores PREs é desconhecida, definir T _b para ~ uma vez o ¹H T 2 da proteína é uma boa estimativa inicial e ainda mais otimizada ajustando T₂ para melhorar o sinal ao ruído. Essa estratégia de medição de dois pontos reduz significativamente o tempo experimental necessário para medir PREs e permite tempo para mais médias de sinal, particularmente porque amostras relativamente diluídas são usadas para minimizar os efeitos de contatos não específicos entre moléculas. Uma sequência de pulso baseada em HSQC é usada para medir ¹H N-T₂ e foi descrita em detalhes em outra publicação³⁰. Para melhorar a sensibilidade, os pulsos duros das transferências INEPT para frente e para trás podem ser substituídos por pulsos moldados; alternativamente, a sequência é prontamente convertida para uma leitura baseada em TROSY³¹. Uma vez que os IDPs tipicamente têm taxas de relaxamento transversal muito mais longas, resultando em larguras de linha mais estreitas (devido à desordem inerente) do que proteínas globulares de tamanho semelhante, longos tempos de aquisição na dimensão indireta podem ser usados para melhorar a resolução espectral e aliviar a limitação de dispersão de deslocamento químico inerente aos IDPs.

PRE é uma ferramenta útil para estudar interações proteína-proteína e proteína-ácido nucleico, particularmente interações que são transitórias ou pouco povoadas. Um protocolo detalhado para a preparação de uma amostra de RMN adequada para medir PREs, incluindo etapas para purificação de proteínas, marcação de spin direcionada ao local, configuração e calibração do programa de pulso, processamento e interpretação dos dados de RMN, é fornecido. Considerações experimentais importantes são observadas ao longo do tempo que podem afetar a qualidade dos dados e os resultados experimentais, incluindo a concentração da amostra, a seleção do spin-label e a remoção de componentes paramagnéticos.