天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

内因性障害(ID)は、安定した二次構造または三次構造に自発的に折りたたまれないが生物学的に活性であるタンパク質(IDP)またはタンパク質内の領域(IDR)を表します。一般に、IDP/IDRの機能は、^{生理学的条件1}で生体分子との特異的でありながら可逆的な相互作用を促進することです。したがって、IDPおよびIDRは、多タンパク質複合体の動員、組織化、および安定化、例えば、スプライソソーム²の組み立ておよび活性、DNA損傷部位における成分の動員および組織化³、転写複合体⁴、またはクロマチンリモデリング^BAF5の組織化および安定化を含む、様々な細胞機能に関与している.さらに、IDPはシグナル伝達ネクサスに見られ、異なる結合パートナーとの乱交により、細胞タンパク質ネットワークを介した情報伝達を媒介することができます⁶。最近の研究では、IDR領域が液-液相分離のプロセスを通じて生体分子凝縮物を自己会合形成する傾向も明らかになりました⁷。IDを含む前述の機能の多くは、現在、凝縮物形成⁸のいくつかの側面を含むと考えられています。生体分子複合体の組み立て、安定化、足場、およびシグナル伝達にとってIDは重要であるにもかかわらず、IDPおよびIDRは通常、X線結晶構造解析または極低温電子顕微鏡を使用した構造調査に適していないため、それらの特異的相互作用の原子の詳細を特定することは困難です。

核磁気共鳴(NMR)は、剛直または均質な構造アンサンブルの存在に依存せず、個々の原子核の直接の局所環境を報告するため、IDを調べるための理想的な手法です。所与の分子内の原子核の共鳴周波数または化学シフトは、局所的な電子分布によって誘発される弱い磁場の影響を受け、結合長、角度、他の原子核の近さ、結合パートナーとの相互作用、およびその他の要因に依存します⁹。したがって、各核は、その局所的な化学環境の変化に敏感な独自の部位特異的構造プローブとして機能します。これらの利点にもかかわらず、NMRはバルク技術であり、観測された化学シフトは特定の核によってサンプリングされたすべての環境の平均です。この号で取り上げるNMR技術の多くは、平均化された化学シフトに含まれる高エネルギーで人口の少ない生体分子立体構造に関する構造的、動的、および速度論的情報を回復するために開発されました^10,11。一過性に人口が存在しますが、これらの状態の同定と定量化は、機能メカニズムの詳細を決定するために重要です¹²。例えば、IDPおよびIDRの場合、立体配座アンサンブルは、生理学的結合パートナーとの遭遇複合体の形成に生産的である立体配座を優先的にサンプリングするように偏っている可能性がある。これらの状態の検出、ならびに残基特異的な分子間および分子内相互作用およびダイナミクスの同定は、タンパク質機能と複合体形成の根底にある構造メカニズムを決定するために重要です。

常磁性緩和増強(PRE)NMRを使用して、IDP/IDRを介した生体分子複合体の形成に重要な過渡的で人口の少ない状態を調べるためのプロトコルについて説明します¹³。このアプローチは、α-シヌクレイン^14,15からのアミロイド線維の集合やFUS 16の自己会合を促進するような一過性のタンパク質間相互作用の研究や、シグナル伝達タンパク質間などの特定のタンパク質間相互作用を特徴付けるのに役立ちます¹⁷。自己会合性IDPの例が提示され、特定の分子間および分子内相互作用が優先的に圧縮された状態をもたらし、自己会合を促進する部位特異的相互作用をもたらします。

PREは、原子核から常磁性中心への磁気双極子相互作用から等方性gテンソルで生じ、一般にニトロキシド基上の不対電子の形で、または常磁性金属原子として供給されます¹⁸(図1)。異方性のgテンソルを持つ原子もPRE効果を生じますが、これらの系の解析は、擬似接触シフト(PCS)または残留双極子結合(RDC)によって引き起こされる交絡効果のためにより困難です^13,19。原子核と常磁性中心との間の相互作用の強さは、両者の間の<^r-6>距離に依存する。この相互作用は核緩和率の増加をもたらし、不対電子の磁気モーメントが非常に強いため、長距離相互作用(~10-35 Å)でも検出可能な線の広がりを引き起こします^20,21。PREによる過渡状態の検出は、次の2つの条件が満たされている場合に可能です。(1)過渡的相互作用はNMRタイムスケールで高速交換中である(観察された化学シフトは交換状態の集団加重平均である)。(2)原子核から常磁性中心までの距離は、過渡的な人口状態の方が主状態¹¹よりも短い。横PREはΓ₂と表され、実用的な目的のために、常磁性中心を含むサンプルと反磁性コントロールとの間の^1H横緩和率の差から計算されます。PREの理論と、高速交換レジームと低速交換レジームにおける関連する疑似接触シフトの詳細な扱いについては、読者はCloreと同僚による包括的なレビューを参照します^13,22。ここでは、¹H N-Γ₂が高速交換レジームにある状況のみが考慮され、PREの^r-6依存性のために、観測された緩和率は、常磁性中心が核に近づく距離とそのコンフォメーションに費やす時間の両方に関連しています。したがって、近接アプローチを伴わない過渡配座は小さなPREを生成し、より近い相互作用は、たとえ短命であっても、より大きなPREを生成します。

IDPの場合、PREは、単一分子内(分子内)および別々の分子間(分子間)で発生する相互作用を測定および区別するために使用されます。NMR可視(^{例えば、15N}標識)またはNMR不可視(例えば、天然存在比^14N)タンパク質に常磁性中心を結合させることにより、PREの供給源(分子間または分子内)を決定することができます(図2)。システイン残基を導入する部位特異的突然変異誘発は、常磁性中心(スピン標識)をタンパク質²³に結合させるための便利なアプローチである。スピン標識として使用するために、金属キレート化(EDTAベース)およびフリーラジカル(ニトロキシドベース)を含むいくつかのタイプの分子が提案されています²⁴。さまざまなニトロキシドスピン標識が記載されており、メタンチオスルホン酸塩、マレイミド、ヨードアセトアミドなどのさまざまなシステイン反応性化学物質で利用できます^25,26(図1)。タグまたはリンカーの固有の柔軟性は、特定の分析にとって問題となる可能性があり、このような状況では、かさばる化学基を追加したり、タグをタンパク質に固定するための第2のリンカーの使用(2部位の結合)など、タグの動きを制限するためのさまざまな戦略が提案されています^27。28。さらに、市販のタグはジアステレオマータンパク質を含み得るが、一般にこれは観察された^PRE29に寄与しないであろう。マレイミド化学を介して遊離システインに結合した3-マレイミド-PROXYLの使用は、容易に入手可能で、費用効果が高く、非可逆的であり、還元剤トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)が標識反応全体を通して溶液中に維持できるため、説明されています。3-Maleimido-PROXYLは等方性のgテンソルを有するため、PCSまたはRDCは誘導されず、常磁性および反磁性サンプルの両方に同じ化学シフト割り当てを使用することができる¹³。

^1H_N−T 2は、8〜12の時点³⁰からなる完全な進化系列を収集するのと同じくらい正確であることが以前に示されている₂つの時点戦略(Ta、T_b)を使用して測定される。第1の時点(Ta)は、実用可能な限りゼロに近く設定され、第2の時点の最適な長さは、所与の試料について予想される最大PREの大きさに依存し、T_b ~ 1.15/(R2,dia + Γ₂)から推定することができ、ここでR2,diaは反磁性試料¹³の_R2を表す。最大のPREの大きさが不明な場合は、_Tbをタンパク質の^1H T2の~1倍に設定することが適切な初期推定値であり、_T2を調整してS/N比を改善することによってさらに最適化されます。この2点測定戦略は、PRESの測定に必要な実験時間を大幅に短縮し、特に分子間の非特異的接触の影響を最小限に抑えるために比較的希薄なサンプルが使用されるため、より多くのシグナル平均化のための時間を可能にします。HSQCベースのパルスシーケンスは、^1H_N−T2を測定するために使用され、他の場所で詳細に説明されている³⁰。感度を向上させるために、順方向および後方のINEPT転送のハードパルスを成形パルスに置き換えることができます。あるいは、配列は、TROSYベースの読み出し³¹に容易に変換される。IDPは通常、横方向の緩和速度がはるかに長いため、同様のサイズの球状タンパク質よりも(固有の障害のために)線幅が狭くなるため、間接次元での長い取得時間を使用して、スペクトル分解能を向上させ、IDPに固有の化学シフト分散の制限を緩和できます。

PREは、タンパク質間およびタンパク質間相互作用、特に一過性または人口の少ない相互作用を研究するための有用なツールです。タンパク質精製、部位特異的スピン標識、パルスプログラムの設定とキャリブレーション、NMRデータの処理と解釈の手順など、PREの測定に適したNMRサンプルを調製するための詳細なプロトコルが提供されています。サンプル濃度、スピン標識の選択、常磁性成分の除去など、データ品質と実験結果に影響を与える可能性のある重要な実験上の考慮事項が全体を通して注目されています。