Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all’interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche¹. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l’organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l’assemblaggio e l’attività dello spliceosoma², il reclutamento e l’organizzazione dei componenti nei siti di danno al DNA³, l’organizzazione e la stabilizzazione del reclutamento dei complessi di trascrizione⁴ o del rimodellatore della cromatina BAF⁵. Inoltre, gli IDP si trovano nei nessi di segnalazione in cui la loro promiscuità per diversi partner di legame consente loro di mediare il trasferimento di informazioni attraverso le reti proteiche cellulari⁶. Recenti lavori hanno anche rivelato una propensione per le regioni IDR ad auto-associare condensati biomolecolari formanti attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido⁷. Molte delle funzioni sopra menzionate che coinvolgono l’ID sono ora pensate per coinvolgere alcuni aspetti della formazione di condensa⁸. Nonostante l’importanza dell’ID per l’assemblaggio di complessi biomolecolari, la stabilizzazione, l’impalcatura e la trasduzione del segnale, i dettagli atomici delle loro interazioni specifiche sono difficili da identificare poiché gli IDP e gli IDR non sono tipicamente suscettibili di indagini strutturali utilizzando la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica criogenica.

La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica ideale per studiare l’ID in quanto non dipende dalla presenza di insiemi strutturali rigidi o omogenei, ma riferisce sull’ambiente locale immediato dei singoli nuclei. La frequenza di risonanza, o spostamento chimico, di un nucleo in una data molecola è influenzata da deboli campi magnetici indotti dalla distribuzione elettronica locale, che a sua volta dipende dalle lunghezze di legame, dagli angoli, dalla vicinanza di altri nuclei, dalle interazioni con i partner di legame e da altri fattori⁹. Pertanto, ogni nucleo agisce come una sonda strutturale unica e specifica del sito sensibile ai cambiamenti nel suo ambiente chimico locale. Nonostante questi vantaggi, la NMR è una tecnica di massa e lo spostamento chimico osservato è la media di tutti gli ambienti campionati da un particolare nucleo. Una serie di tecniche NMR, molte delle quali sono descritte in questo numero, sono state sviluppate per recuperare informazioni strutturali, dinamiche e cinetiche su conformazioni biomolecolari ad alta energia e scarsamente popolate contenute nello spostamento chimico medio^10,11. Sebbene popolati transitoriamente, l’identificazione e la quantificazione di questi stati sono importanti per determinare i dettagli dei meccanismi funzionali¹². Ad esempio, nel caso degli IDP e degli IDR, l’insieme conformazionale può essere distorto per campionare preferenzialmente conformazioni che sono produttive per la formazione di complessi di incontro con partner di legame fisiologici. L’individuazione di questi stati, così come l’identificazione delle interazioni e dinamiche inter- e intra-molecolari specifiche del residuo, sono importanti per determinare i meccanismi strutturali sottostanti alla funzione e alla formazione delle proteine.

Viene descritto un protocollo per l’utilizzo della NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico (PRE) per studiare stati transitori e scarsamente popolati importanti per la formazione di complessi biomolecolari mediati da IDP/IDR¹³. Questo approccio è utile per studiare le interazioni transitorie proteina-proteina come quelle che promuovono l’assemblaggio di fibrille amiloidi da α-sinucleina 14,15 o l’autoassociazione di FUS^16, nonché per caratterizzare specifiche interazioni proteina-proteina come tra proteine di segnalazione¹⁷. Viene presentato un esempio di IDP auto-associante, in cui specifiche interazioni inter- e intra-molecolari si traducono in stati preferenzialmente compattati e interazioni sito-specifiche che guidano l’auto-associazione.

Il PRE deriva dall’interazione dipolare magnetica di un nucleo ad un centro paramagnetico con un tensore g isotropo, comunemente fornito sotto forma di un elettrone spaiato su un gruppo nitroxide o come atomo metallico paramagnetico¹⁸ (Figura 1). Mentre gli atomi con tensori g anisotropi producono anche un effetto PRE, l’analisi di questi sistemi è più difficile a causa degli effetti confondenti forniti dagli spostamenti pseudo-di contatto (PCS) o dall’accoppiamento dipolare residuo (RDC)^13,19. La forza dell’interazione tra un nucleo e il centro paramagnetico dipende dalla distanza <^r-6> tra i due. Questa interazione si traduce in un aumento dei tassi di rilassamento nucleare, che causa un allargamento della linea rilevabile anche per interazioni a lungo raggio (~10-35 Å), perché il momento magnetico dell’elettrone spaiato è così forte^20,21. Il rilevamento di stati transitori con il PRE è possibile se sono soddisfatte le seguenti due condizioni; (1) l’interazione transitoria è in rapido scambio sulla scala temporale NMR (lo spostamento chimico osservato è una media ponderata per la popolazione degli stati di scambio); e (2) la distanza tra nuclei e centro paramagnetico è più breve nello stato popolato transitoriamente che nello stato maggiore¹¹. Il PRE trasversale è indicato con Γ₂ e, per motivi pratici, è calcolato dalla differenza nei tassi di rilassamento trasversale ¹H tra un campione contenente un centro paramagnetico e un controllo diamagnetico. Per una trattazione approfondita della teoria del PRE e dei relativi spostamenti pseudo-di contatto nei regimi di scambio rapido e lento, si rimanda il lettore alle recensioni complete di Clore e collaboratori^13,22. Qui, viene considerata solo la situazione in cui ¹H N-Γ₂ è nel regime di scambio veloce, dove a causa della dipendenza ^r-6 del PRE, il tasso di rilassamento osservato è correlato sia alla distanza a cui il centro paramagnetico si avvicina al nucleo sia alla quantità di tempo che trascorre in quella conformazione. Pertanto, le conformazioni transitorie che non implicano un approccio ravvicinato producono un piccolo PRE mentre interazioni più strette, anche se di breve durata, produrranno un PRE più grande.

Per gli IDP, il PRE viene utilizzato per misurare e differenziare le interazioni che si verificano all’interno di una singola molecola (intramolecolare) e tra molecole separate (intermolecolari). Attaccando un centro paramagnetico a una proteina NMR visibile (ad esempio, ¹⁵N-marcata) o NMR invisibile (ad esempio, abbondanza naturale ¹⁴N), è possibile determinare la fonte (inter- o intra-molecolare) del PRE (Figura 2). La mutagenesi sito-diretta che introduce un residuo di cisteina è un approccio conveniente per attaccare un centro paramagnetico (spin-label) a una proteina²³. Sono stati proposti diversi tipi di molecole per l’uso come etichette di spin, tra cui la chelazione dei metalli (a base di EDTA) e i radicali liberi (a base di nitroxide)²⁴. Sono state descritte varie etichette di spin nitroxide e sono disponibili con diverse sostanze chimiche reattive alla cisteina come metanetiosolfonato, maleimmide e iodoacetamide^25,26 (Figura 1). La flessibilità intrinseca del tag o del linker può essere problematica per alcune analisi e, in queste situazioni, sono state proposte diverse strategie per limitare il movimento del tag, ad esempio aggiungendo gruppi chimici ingombranti o l’uso di un secondo linker per ancorare il tag alla proteina (attacco a due siti)^{27, 28}. Inoltre, i tag disponibili in commercio possono contenere proteine diastereomeriche, ma generalmente ciò non contribuirà al PRE²⁹ osservato. L’uso del 3-Maleimido-PROXYL legato ad una cisteina libera tramite chimica maleimmide è descritto poiché è prontamente disponibile, economico, non reversibile e l’agente riducente tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) può essere mantenuto nella soluzione per tutta la reazione di etichettatura. Poiché 3-Maleimido-PROXYL ha un tensore g isotropo, non vengono indotti PCS o RDC e le stesse assegnazioni di spostamento chimico possono essere utilizzate sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici¹³.

^L’1H_{N-T 2} viene misurato utilizzando una strategia a due punti temporali (T a, T_b) che in precedenza ha dimostrato di essere accurata quanto la raccolta di una serie di evoluzione completa composta da 8 _a 12 punti temporali³⁰. Il primo punto temporale (T _a) è fissato il più vicino possibile allo zero e la lunghezza ottimale del secondo punto temporale dipende dalla grandezza del PRE più grande atteso per un dato campione e può essere stimato da: T_b ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) dove R _2,dia rappresenta l’R ₂ del campione diamagnetico¹³. Se la grandezza dei PRE più grandi è sconosciuta, impostare T _b a ~ una volta ^l’1H T 2 della proteina è una buona stima iniziale e ulteriormente ottimizzata regolando T₂ per migliorare il segnale al rumore. Questa strategia di misurazione a due punti riduce significativamente il tempo sperimentale necessario per misurare i PR e consente di calcolare la media del segnale, in particolare perché vengono utilizzati campioni relativamente diluiti per ridurre al minimo gli effetti dei contatti non specifici tra le molecole. Una sequenza di impulsi basata su HSQC viene utilizzata per misurare ¹H N-T₂ ed è stata descritta in dettaglio altrove³⁰. Per una migliore sensibilità, gli impulsi duri dei trasferimenti INEPT avanti e indietro possono essere sostituiti con impulsi sagomati; in alternativa, la sequenza viene prontamente convertita in una lettura basata su TROSY³¹. Poiché gli IDP hanno tipicamente tassi di rilassamento trasversale molto più lunghi con conseguenti larghezze di linea più strette (a causa del disturbo intrinseco) rispetto alle proteine globulari di dimensioni simili, lunghi tempi di acquisizione nella dimensione indiretta possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione spettrale e alleviare la limitazione della dispersione dello spostamento chimico inerente agli IDP.

PRE è uno strumento utile per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico, in particolare le interazioni che sono transitorie o scarsamente popolate. Viene fornito un protocollo dettagliato per la preparazione di un campione NMR adatto alla misurazione dei PRE, comprese le fasi per la purificazione delle proteine, l’etichettatura dello spin diretto al sito, l’impostazione e la calibrazione del programma di impulsi, l’elaborazione e l’interpretazione dei dati NMR. Importanti considerazioni sperimentali sono notate in tutto ciò che può influire sulla qualità dei dati e sui risultati sperimentali, compresa la concentrazione del campione, la selezione dell’etichetta di spin e la rimozione dei componenti paramagnetici.