שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם
Summary
מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.
Abstract
חלבונים בעלי אי-סדר פנימי ואזורים בעלי אי-סדר פנימי בתוך חלבונים מהווים חלק גדול ומשמעותי מבחינה תפקודית של הפרוטאום האנושי. האופי הגמיש מאוד של רצפים אלה מאפשר להם ליצור אינטראקציות חלשות, ארוכות טווח וחולפות עם שותפים ביומולקולריים מגוונים. אינטראקציות ספציפיות אך בעלות זיקה נמוכה מקדמות קשירה מופקרת ומאפשרות לפלח יחיד בעל הפרעה מהותית לקיים אינטראקציה עם מספר רב של אתרי יעד. בגלל האופי הארעי של אינטראקציות אלה, קשה לאפיין אותן באמצעות שיטות ביולוגיות מבניות המסתמכות על חלבונים כדי ליצור קונפורמציה אחת דומיננטית. NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית הוא כלי שימושי לזיהוי והגדרה של הבסיס המבני של אינטראקציות חלשות וחולפות. מתואר פרוטוקול מפורט לשימוש בשיפור הרפיה פאראמגנטי כדי לאפיין את קומפלקסי המפגש המאוכלסים בצפיפות נמוכה הנוצרים בין חלבונים בעלי הפרעה פנימית לבין החלבון, חומצת הגרעין או שותפים ביומולקולריים אחרים שלהם.
Introduction
הפרעה פנימית (ID) מתארת חלבונים (IDPs) או אזורים בתוך חלבונים (IDR) שאינם מתקפלים באופן ספונטני למבנים יציבים, משניים או שלישוניים, אך פעילים ביולוגית. באופן כללי, תפקידם של IDP / IDR הוא להקל על אינטראקציות ספציפיות אך הפיכות עם ביומולקולות בתנאים פיזיולוגיים1. לפיכך, עקורים ו-IDR מעורבים במגוון תפקודים תאיים, כולל גיוס, ארגון וייצוב של קומפלקסים מרובי חלבונים, למשל, הרכבה ופעילות של הספליסוזום2, גיוס וארגון רכיבים באתרים של נזק לדנ”א3, ארגון וייצוב הגיוס של מתחמי שעתוק4, או של מעצב הכרומטין BAF5. בנוסף, עקורים נמצאים בקשרי איתות, כאשר הפקרותם לשותפים כובלים שונים מאפשרת להם לתווך העברת מידע דרך רשתות חלבונים תאיות6. עבודה שנעשתה לאחרונה חשפה גם נטייה של אזורי IDR לקשר את עצמם ליצירת עיבויים ביומולקולריים באמצעות תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית7. רבות מהפונקציות הנ”ל המערבות ID נחשבות כיום גם ככוללות היבט כלשהו של היווצרות עיבוי8. למרות חשיבותו של ID להרכבה ביומולקולרית מורכבת, ייצוב, פיגומים והעברת אותות, קשה לזהות את הפרטים האטומיים של האינטראקציות הספציפיות שלהם מכיוון שבדרך כלל עקורים ו- IDR אינם ניתנים לחקירה מבנית באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכניקה אידיאלית לחקר זיהוי מכיוון שהיא אינה תלויה בנוכחותם של הרכבים מבניים קשיחים או הומוגניים אלא מדווחת על הסביבה המקומית המיידית של גרעינים בודדים. תדירות התהודה, או השינוי הכימי, של גרעין במולקולה נתונה מושפעת משדות מגנטיים חלשים הנגרמים על ידי הפיזור האלקטרוני המקומי, שבתורו תלוי באורכי קשר, זוויות, קרבה של גרעינים אחרים, אינטראקציות עם שותפים קושרים וגורמים אחרים9. לפיכך, כל גרעין פועל כבדיקה מבנית ייחודית, ספציפית לאתר, הרגישה לשינויים בסביבתו הכימית המקומית. למרות יתרונות אלה, NMR היא טכניקה בתפזורת, והשינוי הכימי שנצפה הוא הממוצע של כל הסביבות שנדגמו על ידי גרעין מסוים. מגוון טכניקות NMR, שרבות מהן מתוארות בגיליון זה, פותחו כדי לשחזר מידע מבני, דינמי וקינטי על קונפורמציות ביומולקולריות בעלות אנרגיה גבוהה המאוכלסות נמוך הכלולות בשינוי הכימי הממוצע10,11. למרות שהם מאוכלסים באופן ארעי, זיהוי וכימות של מצבים אלה חשובים לקביעת הפרטים של מנגנונים פונקציונליים12. לדוגמה, במקרה של עקורים ו-IDRs, ההרכב הקונפורמטיבי עשוי להיות מוטה למדגם מועדף של קונפורמציות המועילות ליצירת מתחמי מפגש עם שותפים מחייבים פיזיולוגיים. זיהוי מצבים אלה, כמו גם זיהוי של אינטראקציות ודינמיקות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות ספציפיות לשאריות, חשובים כדי לקבוע את המנגנונים המבניים הבסיסיים של תפקוד חלבונים והיווצרות מורכבת.
פרוטוקול לשימוש ב-NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית (PRE) כדי לחקור מצבים ארעיים המאוכלסים באוכלוסייה נמוכה החשובים להיווצרות קומפלקסים ביומולקולריים בתיווך IDP / IDR מתואר13. גישה זו שימושית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות, כגון אלה המקדמות הרכבה של סיבי עמילואיד מ-α-סינוקלאין 14,15 או הקשר העצמי של FUS16, כמו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות כגון בין חלבוני איתות17. מוצגת דוגמה לשיוך עצמי של IDP, שבו אינטראקציות בין-מולקולריות ספציפיות ותוך-מולקולריות גורמות למצבים דחוסים מועדפים, כמו גם אינטראקציות ספציפיות לאתר המניעות אסוציאציה עצמית.
ה-PRE נובע מהאינטראקציה הדיפולרית המגנטית של גרעין למרכז פאראמגנטי עם טנזור G איזוטרופי, המסופק בדרך כלל בצורה של אלקטרון לא מזווג על קבוצת חנקן אוקסיד או כאטום מתכת פאראמגנטי18 (איור 1). בעוד אטומים עם טנזור G אנאיזוטרופי מייצרים גם אפקט PRE, ניתוח של מערכות אלה קשה יותר בשל השפעות מבלבלות שנתרמו על ידי משמרות מגע מדומה (PCS) או צימוד דיפולרי שיורי (RDC)13,19. עוצמת האינטראקציה בין גרעין למרכז פאראמגנטי תלויה במרחק <r-6> בין השניים. אינטראקציה זו גורמת לעלייה בקצב ההרפיה הגרעינית, מה שגורם להרחבת קווים הניתנים לגילוי אפילו עבור אינטראקציות ארוכות טווח (~ 10-35 Å), מכיוון שהמומנט המגנטי של האלקטרון הבלתי מזווג הוא כה חזק20,21. זיהוי מצבים ארעיים עם PRE אפשרי אם מתקיימים שני התנאים הבאים; (1) האינטראקציה הארעית היא בחליפין מהיר על ציר הזמן של NMR (השינוי הכימי שנצפה הוא ממוצע משוקלל אוכלוסייה של המדינות המחליפות); ו-(2) מרחק הגרעינים למרכז הפאראמגנטי קצר יותר במצב המאוכלס באופן ארעי מאשר במצב העיקרי11. ה- PRE הרוחבי מסומן Γ2 ולמטרות מעשיות מחושב מההפרש בקצבי הרפיה רוחביים של 1H בין דגימה המכילה מרכז פאראמגנטי לבין בקרה דיאמגנטית. לטיפול מעמיק בתיאוריה של PRE ושינויים פסאודו-קונטאזטיים הקשורים אליה במשטרי חליפין מהירים ואיטיים מופנה הקורא לסקירות המקיפות של קלור ועמיתיו13,22. כאן, רק המצב שבו 1H N-Γ2 נמצא במשטר החליפין המהיר נחשב, שבו בגלל התלות r-6 של PRE, קצב ההרפיה שנצפה קשור הן למרחק שאליו המרכז הפאראמגנטי מתקרב לגרעין והן לכמות הזמן שהוא מבלה באותה קונפורמציה. לכן, קונפורמציות ארעיות שאינן כרוכות בגישה קרובה מייצרות PRE קטן בעוד שאינטראקציות קרובות יותר, גם אם קצרות מועד, ייצרו PRE גדול יותר.
עבור עקורים, ה- PRE משמש למדידה ולהבחנה של האינטראקציות המתרחשות בתוך מולקולה אחת (תוך מולקולרית) ובין מולקולות נפרדות (בין מולקולרית). על-ידי הצמדת מרכז פאראמגנטי לחלבון NMR גלוי (למשל, 15N-מסומן) או NMR בלתי נראה (למשל, שפע טבעי 14N), ניתן לקבוע את המקור (הבין-מולקולרי או התוך-מולקולרי) של ה-PRE (איור 2). מוטגנזה מכוונת אתר המציגה שאריות ציסטאין היא גישה נוחה להצמדת מרכז פאראמגנטי (תווית ספין) לחלבון23. מספר סוגים של מולקולות הוצעו לשימוש כתוויות ספין, כולל כלאט מתכת (מבוסס EDTA) ורדיקל חופשי (מבוסס חנקן)24. תוויות שונות של ספין חנקן תוארו והן זמינות עם כימיות תגובתיות שונות לציסטאין כגון מתאתיוסולפונט, מלימיד ויודואצטמיד25,26 (איור 1). גמישות מובנית של התג או של המקשר עלולה להיות בעייתית עבור ניתוחים מסוימים, ובמצבים אלה הוצעו אסטרטגיות שונות להגבלת תנועת התג, כגון על ידי הוספת קבוצות כימיות מגושמות או שימוש במקשר שני כדי לעגן את התג לחלבון (חיבור לשני אתרים)27, 28. בנוסף, תגים זמינים מסחרית עשויים להכיל חלבונים דיאסטריאומריים אך בדרך כלל זה לא יתרום ל- PRE29 שנצפה. השימוש ב-3-Maleimido-PROXYL המחובר לציסטאין חופשי באמצעות כימיה של maleimide מתואר מכיוון שהוא זמין, חסכוני, בלתי הפיך, וניתן לשמור על החומר המחזר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) בתמיסה לאורך כל תגובת התוויה. מכיוון של-3-Maleimido-PROXYL יש טנזור G איזוטרופי, לא מושרים PCS או RDC, וניתן להשתמש באותן הקצאות שינוי כימיות הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות13.
1H N-T2 נמדד באמצעות אסטרטגיית שתי נקודות זמן (T a, Tb) שהוכחה בעבר כמדויקת כמו איסוף סדרת אבולוציה מלאה המורכבת מ-8 עד 12 נקודות זמן30. נקודת הזמן הראשונה (T a) מוגדרת קרוב לאפס כמעשית, והאורך האופטימלי של נקודת הזמן השנייה תלוי בגודל ה-PRE הגדול ביותר הצפוי עבור מדגם נתון וניתן להעריך אותו מ: Tb ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R 2,dia מייצג את R 2 של המדגם הדיאמגנטי13. אם סדר הגודל של ה- PREs הגדולים ביותר אינו ידוע, הגדרת T b ל~ פי 1H T 2 של החלבון היא הערכה ראשונית טובה וממוטבת עוד יותר על ידי התאמת T2 כדי לשפר את האות לרעש. אסטרטגיית מדידה דו-נקודתית זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן הניסוי הדרוש למדידת PREs ומאפשרת זמן לממוצע אותות רב יותר, במיוחד מכיוון שדגימות מדוללות יחסית משמשות למזעור ההשפעות של מגעים לא ספציפיים בין מולקולות. רצף פולסים מבוסס HSQC משמש למדידת 1HN-T 2 ותואר בפירוט במקום אחר30. לשיפור הרגישות, ניתן להחליף את הפולסים הקשיחים של העברות INEPT קדימה ואחורה בפולסים מעוצבים; לחלופין, הרצף מומר בקלות לקריאה31 מבוססת TROSY. מכיוון שלעקורים יש בדרך כלל שיעורי הרפיה רוחביים ארוכים בהרבה וכתוצאה מכך רוחב קו צר יותר (בשל ההפרעה המובנית) מאשר חלבונים כדוריים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים בממד העקיף כדי לשפר את הרזולוציה הספקטרלית ולהקל על מגבלת פיזור השינוי הכימי הטבועה בעקורים.
PRE הוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-חומצות גרעין, במיוחד אינטראקציות חולפות או מאוכלסות נמוך. מצורף פרוטוקול מפורט להכנת דגימת NMR המתאימה למדידת PREs, כולל שלבים לטיהור חלבונים, תיוג ספין מכוון אתר, הגדרה וכיול של תוכנית הדופק, עיבוד ופענוח נתוני NMR. לאורך כל הדרך מצוינים שיקולים ניסיוניים חשובים שעשויים להשפיע על איכות הנתונים ותוצאות הניסוי, כולל ריכוז הדגימה, בחירת תווית הספין והסרת רכיבים פאראמגנטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוצגה שיטה לאפיון אינטראקציות חולפות הקיימות באוכלוסיות נמוכות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית לבין שותפים קושרים שונים באמצעות PRE. בדוגמה המוצגת, החלבון הוא שיוך עצמי, ולכן PRE עשוי לנבוע משילוב של אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות. שיטה זו מורחבת בקלות לדגימות הטרוגניות שבהן נית?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ג’ינפה יינג וד”ר קריסטין קאנו על דיונים מועילים וסיוע טכני. DSL הוא מלגאי סנט בלדריק ומכיר בתמיכת קרן סנט בלדריק (634706). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן וולש (AQ-2001-20190330) ל-DSL, קרן מקס ומיני טומרלין וולקר (מענק חוקר צעיר של קרן וולקר ל-DSL), קרנות סטארט-אפ של UTHSA ל-DSL, ומלגת בוגר גריהי בבריאות ילדים ל-CNJ. עבודה זו מבוססת על מחקר שנערך במתקני הליבה של ביולוגיה מבנית, חלק מליבות המחקר המוסדיות במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו בתמיכת משרד סגן הנשיא למחקר ומרכז הסרטן מייס גילוי תרופות וביולוגיה מבנית משאב משותף (NIH P30 CA054174).
Materials
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 – 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al. Intrinsic disorder in transcription factors. Biochemistry. 45 (22), 6873-6888 (2006).
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. . Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. . NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein — site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82 (1), 70-77 (1959).
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
