Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Intrinsische Störung (ID) beschreibt Proteine (IDPs) oder Regionen innerhalb von Proteinen (IDRs), die sich nicht spontan zu stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen falten, sondern biologisch aktiv sind. Im Allgemeinen besteht die Funktion von IDP/IDRs darin, spezifische, aber reversible Wechselwirkungen mit Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen¹. Somit sind IDPs und IDRs an einer Reihe von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Rekrutierung, Organisation und Stabilisierung von Multi-Protein-Komplexen, z. B. der Assemblierung und Aktivität des Spleißosoms², der Rekrutierung und Organisation von Komponenten an den Stellen der DNA-Schädigung³, der Organisation und Stabilisierung der Rekrutierung von Transkriptionskomplexen⁴ oder des Chromatin-Remodelers BAF⁵. Darüber hinaus werden IDPs an Signalknoten gefunden, wo ihre Promiskuität für verschiedene Bindungspartner es ihnen ermöglicht, den Informationstransfer durch zelluläre Proteinnetzwerke zu vermitteln⁶. Neuere Arbeiten haben auch gezeigt, dass IDR-Regionen dazu neigen, sich selbst zu assoziieren und biomolekulare Kondensate durch den Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung zu bilden⁷. Viele der oben erwähnten Funktionen, die ID betreffen, werden heute auch mit einem Aspekt der Kondensatbildung in Verbindung gebracht⁸. Trotz der Bedeutung von ID für die Assemblierung, Stabilisierung, Gerüstbildung und Signaltransduktion biomolekularer Komplexe sind die atomaren Details ihrer spezifischen Wechselwirkungen schwer zu identifizieren, da IDPs und IDRs in der Regel nicht für strukturelle Untersuchungen mit Röntgenkristallographie oder kryogener Elektronenmikroskopie geeignet sind.

Die Kernspinresonanz (NMR) ist eine ideale Technik zur Untersuchung der ID, da sie nicht vom Vorhandensein starrer oder homogener Strukturensembles abhängt, sondern über die unmittelbare lokale Umgebung einzelner Kerne berichtet. Die Resonanzfrequenz oder chemische Verschiebung eines Kerns in einem bestimmten Molekül wird durch schwache Magnetfelder beeinflusst, die durch die lokale elektronische Verteilung induziert werden, die wiederum von Bindungslängen, Winkeln, der Nähe anderer Kerne, Wechselwirkungen mit Bindungspartnern und anderen Faktoren abhängt⁹. So fungiert jeder Kern als einzigartige, ortsspezifische Struktursonde, die empfindlich auf Veränderungen in seiner lokalen chemischen Umgebung reagiert. Trotz dieser Vorteile ist die NMR eine Bulk-Technik, und die beobachtete chemische Verschiebung ist der Durchschnitt aller Umgebungen, die von einem bestimmten Kern beprobt wurden. Eine Reihe von NMR-Techniken, von denen viele in dieser Ausgabe beschrieben werden, wurden entwickelt, um strukturelle, dynamische und kinetische Informationen über hochenergetische, niedrig besiedelte biomolekulare Konformationen zu gewinnen, die in der gemittelten chemischen Verschiebung enthalten^{sind 10,11}. Obwohl sie nur vorübergehend besiedelt sind, sind die Identifizierung und Quantifizierung dieser Zustände wichtig, um die Details der funktionellen Mechanismen zu bestimmen¹². Zum Beispiel kann im Fall von IDPs und IDRs das Konformationsensemble verzerrt sein, um bevorzugt Konformationen zu probieren, die für die Bildung von Begegnungskomplexen mit physiologischen Bindungspartnern produktiv sind. Die Detektion dieser Zustände sowie die Identifizierung der restspezifischen inter- und intramolekularen Wechselwirkungen und Dynamiken sind wichtig, um die zugrundeliegenden strukturellen Mechanismen der Proteinfunktion und Komplexbildung zu bestimmen.

Es wird ein Protokoll zur Verwendung der paramagnetischen Relaxationsverstärkung (PRE) NMR zur Untersuchung transienter, niedrig besiedelter Zustände beschrieben, die für die Bildung von IDP/IDR-vermittelten biomolekularen Komplexen wichtig sind¹³. Dieser Ansatz ist nützlich für die Untersuchung der transienten Protein-Protein-Interaktionen, wie z. B. solche, die den Aufbau von Amyloidfibrillen aus α-Synuclein 14,15 oder die Selbstassoziation von FUS¹⁶ fördern, sowie für die Charakterisierung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen^, z. B. zwischen Signalproteinen¹⁷. Ein Beispiel für eine selbstassoziierende IDP wird vorgestellt, bei der spezifische inter- und intramolekulare Wechselwirkungen zu bevorzugt verdichteten Zuständen sowie zu ortsspezifischen Wechselwirkungen führen, die die Selbstassoziation vorantreiben.

Die PRE entsteht aus der magnetischen dipolaren Wechselwirkung eines Kerns mit einem paramagnetischen Zentrum mit einem isotropen g-Tensor, der üblicherweise in Form eines ungepaarten Elektrons auf einer Nitroxidgruppe oder als paramagnetisches Metallatom¹⁸ geliefert wird (Abbildung 1). Während Atome mit anisotropen g-Tensoren auch einen PRE-Effekt erzeugen, ist die Analyse dieser Systeme aufgrund von Störeffekten, die durch die Pseudo-Kontaktverschiebungen (PCS) oder die residuale dipolare Kopplung (RDC) verursacht werden, ^{schwieriger13,19}. Die Stärke der Wechselwirkung zwischen einem Kern und dem paramagnetischen Zentrum hängt vom Abstand <^r-6> zwischen den beiden ab. Diese Wechselwirkung führt zu einem Anstieg der Kernrelaxationsraten, was zu einer nachweisbaren Linienverbreiterung auch für langreichweitige Wechselwirkungen (~10-35 Å) führt, da das magnetische Moment des ungepaarten Elektrons so stark ist^20,21. Die Erkennung von transienten Zuständen mit dem PRE ist möglich, wenn die folgenden beiden Bedingungen erfüllt sind; (1) die transiente Wechselwirkung befindet sich in schnellem Austausch auf der NMR-Zeitskala (beobachtete chemische Verschiebung ist ein populationsgewichteter Durchschnitt der austauschenden Zustände); und (2) der Abstand zwischen Kernen und paramagnetischem Schwerpunkt ist im vorübergehend besiedelten Zustand kürzer als im Hauptzustand¹¹. Die transversale PRE wird Γ₂ bezeichnet und aus praktischen Gründen aus der Differenz der ^{transversalen}Relaxationsraten von 1 H zwischen einer Probe mit einem paramagnetischen Zentrum und einer diamagnetischen Steuerung berechnet. Für eine eingehende Behandlung der Theorie der PRE und der damit verbundenen Pseudokontaktverschiebungen in schnellen und langsamen Austauschregimen wird der Leser auf die umfassenden Übersichtsarbeiten von Clore und Mitarbeitern^13,22 verwiesen. Hier wird nur die Situation betrachtet, in der sich ¹H_{N-Γ 2} im schnellen Austauschregime befindet, wobei aufgrund der ^{r-6-Abhängigkeit} des PRE die beobachtete Relaxationsrate sowohl mit der Entfernung, in der sich das paramagnetische Zentrum dem Kern nähert, als auch mit der Zeit, die es in dieser Konformation verbringt, zusammenhängt. Daher erzeugen transiente Konformationen, die keine enge Annäherung beinhalten, eine kleine PRE, während nähere Wechselwirkungen, auch wenn sie nur von kurzer Dauer sind, eine größere PRE erzeugen.

Bei IDPs wird der PRE verwendet, um die Wechselwirkungen innerhalb eines einzelnen Moleküls (intramolekular) und zwischen einzelnen Molekülen (intermolekular) zu messen und zu differenzieren. Durch Anbringen eines paramagnetischen Zentrums an ein sichtbares (z. B. ¹⁵N-markiertes) oder NMR-unsichtbares (z. B. ^{natürliches 14}N) Protein kann die Quelle (inter- oder intramolekular) des PRE bestimmt werden (Abbildung 2). Die ortsgerichtete Mutagenese, die einen Cysteinrest einführt, ist ein bequemer Ansatz, um ein paramagnetisches Zentrum (Spin-Label) an ein Protein^{anzuhängen 23}. Es wurden verschiedene Arten von Molekülen für die Verwendung als Spin-Markierungen vorgeschlagen, darunter Metallchelat-Moleküle (EDTA-basiert) und freie Radikale (Nitroxid-basiert)²⁴. Verschiedene Nitroxid-Spin-Markierungen wurden beschrieben und sind mit unterschiedlichen Cystein-reaktiven Chemikalien wie Methanethiosulfonat, Maleimid und Iodacetamid^25,26 erhältlich (Abbildung 1). Die inhärente Flexibilität des Tags oder des Linkers kann für bestimmte Analysen problematisch sein, und in diesen Situationen wurden verschiedene Strategien vorgeschlagen, um die Bewegung des Tags zu begrenzen, z. B. durch Hinzufügen sperriger chemischer Gruppen oder die Verwendung eines zweiten Linkers, um den Tag am Protein zu verankern (Attachment an zwei Stellen^{)27, 28}. S. Darüber hinaus können kommerziell erhältliche Tags diastereomere Proteine enthalten, was jedoch im Allgemeinen nicht zu der beobachteten PRE²⁹ beiträgt. Die Verwendung des 3-Maleimido-PROXYLS, das über Maleimid-Chemie an ein freies Cystein gebunden ist, wird beschrieben, da es leicht verfügbar, kostengünstig und nicht reversibel ist und das Reduktionsmittel Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) während der gesamten Markierungsreaktion in der Lösung beibehalten werden kann. Da 3-Maleimido-PROXYL einen isotropen g-Tensor aufweist, werden keine PCS oder RDCs induziert, und die gleichen chemischen Verschiebungszuweisungen können sowohl für die paramagnetischen als auch für die diamagnetischen Proben¹³ verwendet werden.

Die ¹H_{N-T 2} wird unter Verwendung einer Zwei-Zeitpunkt-Strategie (T _a, T_b) gemessen, die sich zuvor als so genau erwiesen hat wie das Sammeln einer vollständigen Evolutionsreihe, die aus 8 bis 12 Zeitpunkten besteht³⁰. Der erste Zeitpunkt (T _a) wird so nahe wie möglich an Null gesetzt, und die optimale Länge des zweiten Zeitpunkts hängt von der Größe der größten erwarteten PRE für eine gegebene Probe ab und kann geschätzt werden von: T_b ~ 1,15/(R2,dia + Γ₂), wobei R2,dia die R2 der diamagnetischen Probe¹³ darstellt. Wenn die Größe der größten PREs unbekannt ist, ist die Einstellung von T _b auf ~ das Einfache des ¹H T2 des Proteins eine gute erste Schätzung und wird durch Anpassung von T₂ weiter optimiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Diese Zwei-Punkt-Messstrategie reduziert die experimentelle Zeit, die für die Messung von PREs erforderlich ist, erheblich und ermöglicht mehr Zeit für eine bessere Signalmittelung, zumal relativ verdünnte Proben verwendet werden, um die Auswirkungen unspezifischer Kontakte zwischen Molekülen zu minimieren. Eine HSQC-basierte Pulssequenz wird zur Messung von ¹H_{, N-T2 verwendet und wurde} an anderer Stelle^{ausführlich beschrieben 30}. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, können die harten Impulse der Vorwärts- und Rückwärts-INEPT-Übertragungen durch geformte Impulse ersetzt werden. alternativ kann die Sequenz ohne weiteres in eine TROSY-basierte Auslesung³¹ umgewandelt werden. Da IDPs typischerweise viel längere transversale Relaxationsraten haben, was zu schmaleren Linienbreiten führt (aufgrund der inhärenten Unordnung) als ähnlich große globuläre Proteine, können lange Aufnahmezeiten in der indirekten Dimension genutzt werden, um die spektrale Auflösung zu verbessern und die für IDPs inhärente Begrenzung der chemischen Verschiebungsdispersion zu mildern.

PRE ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Interaktionen, insbesondere von Interaktionen, die vorübergehend oder schwach besiedelt sind. Ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung einer NMR-Probe, die für die Messung von PREs geeignet ist, einschließlich der Schritte zur Proteinaufreinigung, der ortsgerichteten Spinmarkierung, der Einrichtung und Kalibrierung des Pulsprogramms, der Verarbeitung und Interpretation der NMR-Daten, wird bereitgestellt. Es werden wichtige experimentelle Überlegungen angestellt, die sich auf die Datenqualität und das experimentelle Ergebnis auswirken können, einschließlich der Probenkonzentration, der Auswahl der Spin-Markierung und der Entfernung paramagnetischer Komponenten.