Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Le trouble intrinsèque (DI) décrit des protéines (IDP) ou des régions à l’intérieur des protéines (IDR) qui ne se replient pas spontanément en structures secondaires ou tertiaires stables, mais qui sont biologiquement actives. Généralement, la fonction des IDP/IDR est de faciliter des interactions spécifiques mais réversibles avec des biomolécules dans des conditions physiologiques¹. Ainsi, les IDP et les IDR sont impliqués dans une gamme de fonctions cellulaires, y compris le recrutement, l’organisation et la stabilisation de complexes multiprotéiques, par exemple, l’assemblage et l’activité du splicéosome², le recrutement et l’organisation des composants sur les sites de dommages à l’ADN³, l’organisation et la stabilisation du recrutement des complexes de transcription⁴, ou du remodeleur de chromatine BAF⁵. En outre, les PDI se trouvent à des carrefours de signalisation où leur promiscuité pour différents partenaires de liaison leur permet de servir de médiateur dans le transfert d’informations via des réseaux de protéines cellulaires⁶. Des travaux récents ont également révélé une propension des régions IDR à s’associer en formant des condensats biomoléculaires par le processus de séparation en phase liquide-liquide⁷. Bon nombre des fonctions susmentionnées impliquant l’ID sont également considérées comme impliquant un aspect de la formation de condensats⁸. Malgré l’importance de l’ID pour l’assemblage de complexes biomoléculaires, la stabilisation, l’échafaudage et la transduction du signal, les détails atomiques de leurs interactions spécifiques sont difficiles à identifier car les IDP et les IDR ne se prêtent généralement pas à des études structurelles utilisant la cristallographie aux rayons X ou la microscopie électronique cryogénique.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique idéale pour étudier l’ID car elle ne dépend pas de la présence d’ensembles structurels rigides ou homogènes, mais rend compte de l’environnement local immédiat des noyaux individuels. La fréquence de résonance, ou décalage chimique, d’un noyau dans une molécule donnée est influencée par les faibles champs magnétiques induits par la distribution électronique locale, qui à son tour dépend de la longueur des liaisons, des angles, de la proximité d’autres noyaux, des interactions avec les partenaires de liaison et d’autres facteurs⁹. Ainsi, chaque noyau agit comme une sonde structurelle unique, spécifique au site, sensible aux changements de son environnement chimique local. Malgré ces avantages, la RMN est une technique de masse, et le décalage chimique observé est la moyenne de tous les environnements échantillonnés par un noyau particulier. Une gamme de techniques de RMN, dont beaucoup sont décrites dans ce numéro, ont été développées pour récupérer des informations structurelles, dynamiques et cinétiques sur les conformations biomoléculaires à haute énergie et faiblement peuplées contenues dans le décalage chimique moyen^10,11. Bien que transitoirement peuplés, l’identification et la quantification de ces états sont importantes pour déterminer les détails des mécanismes fonctionnels¹². Par exemple, dans le cas des PDI et des IDR, l’ensemble conformationnel peut être biaisé pour échantillonner préférentiellement les conformations productives pour la formation de complexes de rencontre avec des partenaires de liaison physiologiques. La détection de ces états, ainsi que l’identification des interactions et de la dynamique inter- et intramoléculaires spécifiques aux résidus, sont importantes pour déterminer les mécanismes structurels sous-jacents de la fonction protéique et de la formation complexe.

Un protocole d’utilisation de la RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique (PRE) pour étudier les états transitoires et peu peuplés importants pour la formation de complexes biomoléculaires médiés par IDP/IDR est décrit¹³. Cette approche est utile pour étudier les interactions transitoires protéine-protéine telles que celles qui favorisent l’assemblage des fibrilles amyloïdes à partir de la α-synucléine 14,15 ou l’auto-association de FUS^16, ainsi que pour caractériser des interactions protéine-protéine spécifiques telles que entre protéines de signalisation¹⁷. Un exemple d’IDP auto-associatif est présenté, où des interactions inter- et intramoléculaires spécifiques entraînent des états préférentiellement compactés ainsi que des interactions spécifiques au site qui conduisent à l’auto-association.

Le PRE résulte de l’interaction dipolaire magnétique d’un noyau à un centre paramagnétique avec un tenseur g isotrope, généralement fourni sous la forme d’un électron non apparié sur un groupe nitroxide ou sous forme d’atome métallique paramagnétique¹⁸ (Figure 1). Alors que les atomes avec des tenseurs g anisotropes produisent également un effet PRE, l’analyse de ces systèmes est plus difficile en raison des effets de confusion apportés par les décalages de pseudo-contact (PCS) ou le couplage dipolaire résiduel (RDC)^13,19. La force de l’interaction entre un noyau et le centre paramagnétique dépend de la distance <^r-6> entre les deux. Cette interaction entraîne une augmentation des taux de relaxation nucléaire, ce qui provoque un élargissement détectable de la raie même pour les interactions à longue portée (~10-35 Å), car le moment magnétique de l’électron non apparié est si fort^20,21. La détection d’états transitoires avec le PRE est possible si les deux conditions suivantes sont remplies; (1) l’interaction transitoire est en échange rapide sur l’échelle de temps RMN (le déplacement chimique observé est une moyenne pondérée en fonction de la population des états échangeurs); et (2) la distance entre les noyaux et le centre paramagnétique est plus courte à l’état de population transitoire qu’à l’état principal¹¹. Le PRE transversal est noté Γ₂ et, pour des raisons pratiques, est calculé à partir de la différence de vitesse de relaxation transversale ¹H entre un échantillon contenant un centre paramagnétique et un contrôle diamagnétique. Pour un traitement approfondi de la théorie du PRE et des changements de pseudo-contact connexes dans les régimes d’échange rapide et lent, le lecteur est renvoyé aux examens complets de Clore et de ses collègues^13,22. Ici, seule la situation où ¹H N-Γ₂ est dans le régime d’échange rapide est considérée, où, en raison de la dépendance ^r-6 du PRE, le taux de relaxation observé est lié à la fois à la distance à laquelle le centre paramagnétique s’approche du noyau ainsi qu’au temps qu’il passe dans cette conformation. Par conséquent, les conformations transitoires qui n’impliquent pas une approche rapprochée produisent un petit PRE tandis que des interactions plus étroites, même si elles sont de courte durée, produiront un PRE plus grand.

Pour les PDI, le PRE est utilisé pour mesurer et différencier les interactions qui se produisent au sein d’une seule molécule (intramoléculaire) et entre des molécules distinctes (intermoléculaires). En attachant un centre paramagnétique à une protéine RMN visible (p. ex., ¹⁵N-marquée) ou RMN invisible (p. ex., abondance naturelle ¹⁴N), la source (inter- ou intra-moléculaire) de l’ERP peut être déterminée (Figure 2). La mutagénèse dirigée qui introduit un résidu de cystéine est une approche pratique pour attacher un centre paramagnétique (spin-label) à une protéine²³. Plusieurs types de molécules ont été proposés pour être utilisés comme marqueurs de spin, y compris la chélation des métaux (à base d’EDTA) et les radicaux libres (à base de nitroxide)²⁴. Diverses étiquettes de spin de nitroxide ont été décrites et sont disponibles avec différentes chimies réactives à la cystéine telles que le méthanethiosulfonate, le maléimide et l’iodoacétamide^25,26 (Figure 1). La flexibilité inhérente de l’étiquette ou de l’agent de liaison peut être problématique pour certaines analyses, et dans ces situations, différentes stratégies ont été proposées pour limiter le mouvement de l’étiquette, par exemple en ajoutant des groupes chimiques volumineux ou l’utilisation d’un deuxième agent de liaison pour ancrer l’étiquette à la protéine (fixation à deux sites)^{27, 28}. De plus, les étiquettes disponibles dans le commerce peuvent contenir des protéines diastéréomères, mais cela ne contribuera généralement pas à l’ERP²⁹ observée. L’utilisation du 3-Maleimido-PROXYL attaché à une cystéine libre via la chimie maléimide est décrite car il est facilement disponible, rentable, non réversible et l’agent réducteur tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) peut être maintenu dans la solution tout au long de la réaction de marquage. Étant donné que le 3-maléimido-PROXYL possède un tenseur g isotrope, aucun PCS ou RDC n’est induit, et les mêmes assignations de décalage chimique peuvent être utilisées pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques¹³.

Le ¹H_{N-T 2} est mesuré à l’aide d’une stratégie à deux points temporels (T _a, T_b) qui s’est déjà révélée aussi précise que la collecte d’une série d’évolution complète composée de 8 à 12 points temporels³⁰. Le premier point temporel (T _a) est fixé aussi près de zéro que possible, et la longueur optimale du deuxième point de temps dépend de l’amplitude du plus grand PRE attendu pour un échantillon donné et peut être estimée à partir de: T_b ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) où R _2,dia représente le R2 de l’échantillon diamagnétique¹³. Si la magnitude des plus grands PRE est inconnue, définir T _b à ~ une fois le ¹H T 2 de la protéine est une bonne estimation initiale et optimisée en ajustant T₂ pour améliorer le signal au bruit. Cette stratégie de mesure en deux points réduit considérablement le temps expérimental requis pour mesurer les PRE et laisse le temps de faire plus de moyenne des signaux, d’autant plus que des échantillons relativement dilués sont utilisés pour minimiser les effets des contacts non spécifiques entre les molécules. Une séquence d’impulsions basée sur HSQC est utilisée pour mesurer ¹H_{N-T 2} et a été décrite en détail ailleurs³⁰. Pour améliorer la sensibilité, les impulsions dures des transferts INEPT avant et arrière peuvent être remplacées par des impulsions façonnées; alternativement, la séquence est facilement convertie en une lecture basée sur TROSY³¹. Étant donné que les PDI ont généralement des taux de relaxation transversale beaucoup plus longs, ce qui entraîne des largeurs de raies plus étroites (en raison du désordre inhérent) que les protéines globulaires de taille similaire, de longs temps d’acquisition dans la dimension indirecte peuvent être utilisés pour améliorer la résolution spectrale et atténuer la limitation de la dispersion par décalage chimique inhérente aux PDI.

Le PRE est un outil utile pour étudier les interactions protéine-protéine et protéine-acide nucléique, en particulier les interactions transitoires ou peu peuplées. Un protocole détaillé pour la préparation d’un échantillon RMN adapté à la mesure des PRE, y compris les étapes de purification des protéines, le marquage par centrifugation dirigé sur site, la mise en place et l’étalonnage du programme d’impulsions, le traitement et l’interprétation des données RMN, est fourni. D’importantes considérations expérimentales sont notées tout au long de la période qui peuvent avoir une incidence sur la qualité des données et les résultats expérimentaux, y compris la concentration de l’échantillon, la sélection de l’étiquette de spin et l’élimination des composants paramagnétiques.