Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Intrinsieke stoornis (ID) beschrijft eiwitten (IDP’s) of regio’s binnen eiwitten (IDR’s) die zich niet spontaan vouwen tot stabiele secundaire of tertiaire structuren, maar biologisch actief zijn. Over het algemeen is de functie van IDP/IDR’s het vergemakkelijken van specifieke maar omkeerbare interacties met biomoleculen onder fysiologische omstandigheden¹. IDP’s en IDR’s zijn dus betrokken bij een reeks cellulaire functies, waaronder rekrutering, organisatie en stabilisatie van multi-eiwitcomplexen, bijvoorbeeld de assemblage en activiteit van het spliceosoom², rekrutering en organisatie van componenten op plaatsen van DNA-schade³, organisatie en stabilisatie van de rekrutering van transcriptiecomplexen⁴, of van de chromatine-remodeler BAF⁵. Bovendien worden IDP’s gevonden bij signaleringsverbindingen waar hun promiscuïteit voor verschillende bindingspartners hen in staat stelt om informatieoverdracht via cellulaire eiwitnetwerken te bemiddelen⁶. Recent werk heeft ook een neiging aangetoond voor IDR-regio’s om zelf biomoleculaire condensaten te associëren door het proces van vloeistof-vloeistoffasescheiding⁷. Van veel van de bovengenoemde functies met betrekking tot ID wordt nu ook gedacht dat ze een aspect van condensaatvorming^{omvatten 8}. Ondanks het belang van ID voor biomoleculaire complexe assemblage, stabilisatie, steigers en signaaltransductie, zijn de atomaire details van hun specifieke interacties moeilijk te identificeren, omdat IDP’s en IDR’s meestal niet vatbaar zijn voor structureel onderzoek met behulp van röntgenkristallografie of cryogene elektronenmicroscopie.

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een ideale techniek voor het onderzoeken van ID, omdat het niet afhankelijk is van de aanwezigheid van stijve of homogene structurele ensembles, maar rapporteert over de directe lokale omgeving van individuele kernen. De resonantiefrequentie, of chemische verschuiving, van een kern in een bepaald molecuul wordt beïnvloed door zwakke magnetische velden geïnduceerd door de lokale elektronische verdeling, die op zijn beurt afhankelijk is van bindingslengtes, hoeken, nabijheid van andere kernen, interacties met bindingspartners en andere factoren⁹. Elke kern fungeert dus als een unieke, locatiespecifieke structurele sonde die gevoelig is voor veranderingen in zijn lokale chemische omgeving. Ondanks deze voordelen is NMR een bulktechniek en de waargenomen chemische verschuiving is het gemiddelde van alle omgevingen die door een bepaalde kern worden bemonsterd. Een reeks NMR-technieken, waarvan er vele in dit nummer worden beschreven, zijn ontwikkeld om structurele, dynamische en kinetische informatie over hoogenergetische, laagbevolkte biomoleculaire conformaties in de gemiddelde chemische verschuiving^10,11 te herstellen. Hoewel tijdelijk bevolkt, zijn identificatie en kwantificering van deze toestanden belangrijk voor het bepalen van de details van functionele mechanismen¹². In het geval van IDP’s en IDR’s kan het conformatie-ensemble bijvoorbeeld bevooroordeeld zijn om bij voorkeur conformaties te bemonsteren die productief zijn voor de vorming van ontmoetingscomplexen met fysiologische bindingspartners. Detectie van deze toestanden, evenals identificatie van de residuspecifieke inter- en intramoleculaire interacties en dynamiek, zijn belangrijk om de onderliggende structurele mechanismen van eiwitfunctie en complexe vorming te bepalen.

Een protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering (PRE) NMR om voorbijgaande, dunbevolkte toestanden te onderzoeken die belangrijk zijn voor de vorming van IDP / IDR-gemedieerde biomoleculaire complexen wordt beschreven¹³. Deze benadering is nuttig voor het bestuderen van de voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties, zoals die welke de assemblage van amyloïde fibrillen uit α-synucleïne 14,15 of de zelfassociatie van FUS¹⁶ bevorderen, evenals om specifieke eiwit-eiwitinteracties te karakteriseren^, zoals tussen signaaleiwitten¹⁷. Een voorbeeld van een zelf-associërende IDP wordt gepresenteerd, waarbij specifieke inter- en intramoleculaire interacties resulteren in bij voorkeur verdichte toestanden en site-specifieke interacties die zelfassociatie stimuleren.

De PRE ontstaat uit de magnetische dipolaire interactie van een kern met een paramagnetisch centrum met een isotrope g-tensor, gewoonlijk geleverd in de vorm van een ongepaard elektron op een nitroxidegroep of als een paramagnetisch metaalatoom¹⁸ (figuur 1). Hoewel atomen met anisotrope g-tensoren ook een PRE-effect produceren, is analyse van deze systemen moeilijker vanwege verstorende effecten die worden bijgedragen door de pseudo-contactverschuivingen (PCS) of residuele dipolaire koppeling (RDC)^13,19. De sterkte van de interactie tussen een kern en het paramagnetische centrum is afhankelijk van de <^r-6> afstand tussen de twee. Deze interactie resulteert in een toename van nucleaire relaxatiesnelheden, wat detecteerbare lijnverbreding veroorzaakt, zelfs voor langeafstandsinteracties (~ 10-35 Å), omdat het magnetische moment van het ongepaarde elektron zo sterk is^20,21. Detectie van voorbijgaande toestanden met de PRE is mogelijk als aan de volgende twee voorwaarden wordt voldaan; (1) de voorbijgaande interactie is in snelle uitwisseling op de NMR-tijdschaal (waargenomen chemische verschuiving is een populatiegewogen gemiddelde van de uitwisselingstoestanden); en (2) de kernen tot paramagnetische centrumafstand is korter in de tijdelijk bevolkte toestand dan in de hoofdtoestand¹¹. De transversale PRE wordt aangeduid Γ₂ en wordt voor praktische doeleinden berekend uit het verschil in ¹H transversale relaxatiesnelheden tussen een monster met een paramagnetisch centrum en een diamagnetische controle. Voor een diepgaande behandeling van de theorie van de PRE en gerelateerde pseudocontactverschuivingen in snelle en langzame uitwisselingsregimes, wordt de lezer verwezen naar de uitgebreide beoordelingen door Clore en collega’s^13,22. Hier wordt alleen de situatie overwogen waarin ¹H N-Γ₂ zich in het snelle uitwisselingsregime bevindt, waarbij vanwege de r-6-afhankelijkheid van de PRE, de waargenomen relaxatiesnelheid gerelateerd is aan zowel de afstand waartoe het paramagnetische centrum de kern nadert als de hoeveelheid tijd die het in die conformatie doorbrengt. Daarom produceren voorbijgaande conformaties die geen nauwe benadering inhouden een kleine PRE, terwijl nauwere interacties, zelfs als ze van korte duur zijn, een grotere PRE zullen produceren.

Voor IDP’s wordt de PRE gebruikt om de interacties te meten en te differentiëren die plaatsvinden binnen een enkel molecuul (intramoleculair) en tussen afzonderlijke moleculen (intermoleculair). Door een paramagnetisch centrum te hechten aan een NMR zichtbaar (bijv. ¹⁵N-gelabeld) of NMR onzichtbaar (bijv. natuurlijke abundantie ¹⁴N) eiwit, kan de bron (inter- of intramoleculair) van de PRE worden bepaald (figuur 2). Plaatsgerichte mutagenese die een cysteïneresidu introduceert, is een handige benadering om een paramagnetisch centrum (spin-label) aan een eiwit²³ te hechten. Verschillende soorten moleculen zijn voorgesteld voor gebruik als spinlabels, waaronder metaalchelaatvorming (op basis van EDTA) en vrije radicalen (op basis van nitroxide)²⁴. Verschillende nitroxide spin labels zijn beschreven en zijn verkrijgbaar met verschillende cysteïne-reactieve chemische stoffen zoals methanethiosulfonaat, maleimide en iodoacetamide^25,26 (figuur 1). Inherente flexibiliteit van de tag of van de linker kan problematisch zijn voor bepaalde analyses, en in deze situaties zijn verschillende strategieën voorgesteld om de beweging van de tag te beperken, bijvoorbeeld door omvangrijke chemische groepen toe te voegen of het gebruik van een tweede linker om de tag aan het eiwit te verankeren (twee site-attachment)^{27, 28}. Bovendien kunnen in de handel verkrijgbare tags diastereomere eiwitten bevatten, maar over het algemeen zal dit niet bijdragen aan de waargenomen PRE²⁹. Het gebruik van de 3-Maleimido-PROXYL bevestigd aan een vrije cysteïne via maleimide chemie wordt beschreven omdat het direct beschikbaar, kosteneffectief, niet-omkeerbaar is en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende de hele etiketteringsreactie in de oplossing kan worden gehandhaafd. Aangezien 3-Maleimido-PROXYL een isotrope g-tensor heeft, worden er geen PCS of RDC’s geïnduceerd en kunnen dezelfde chemische verschuivingstoewijzingen worden gebruikt voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters¹³.

De ¹H_{N-T 2} wordt gemeten met behulp van een twee-tijdpuntstrategie (T _a, T_b) waarvan eerder is aangetoond dat deze net zo nauwkeurig is als het verzamelen van een volledige evolutiereeks bestaande uit 8 tot 12 tijdpunten³⁰. Het eerste tijdspunt (T _a) wordt zo dicht bij nul ingesteld als praktisch is, en de optimale lengte van het tweede tijdspunt is afhankelijk van de grootte van de grootste verwachte PRE voor een bepaald monster en kan worden geschat vanaf: T_b ~ 1,15 / (R 2, dia + Γ 2) waarbij R 2_{, dia} de R ₂ van het diamagnetische monster¹³ vertegenwoordigt. Als de grootte van de grootste PREs onbekend is, is het instellen van T _b op ~ één keer de ¹H T 2 van het eiwit een goede eerste schatting en verder geoptimaliseerd door T₂ aan te passen om het signaal naar ruis te verbeteren. Deze tweepuntsmeetstrategie vermindert de experimentele tijd die nodig is om PRE’s te meten aanzienlijk en biedt tijd voor meer signaalmiddeling, vooral omdat relatief verdunde monsters worden gebruikt om de effecten van niet-specifieke contacten tussen moleculen te minimaliseren. Een op HSQC gebaseerde pulssequentie wordt gebruikt om ¹H N-T₂ te meten en is elders in detail beschreven³⁰. Voor een betere gevoeligheid kunnen de harde pulsen van de voorwaartse en achterste INEPT-overdrachten worden vervangen door gevormde pulsen; als alternatief kan de reeks gemakkelijk worden geconverteerd naar een op TROSY gebaseerde uitlezing³¹. Aangezien IDP’s doorgaans veel langere transversale relaxatiesnelheden hebben, wat resulteert in smallere lijnbreedtes (vanwege de inherente aandoening) dan bolvormige eiwitten van vergelijkbare grootte, kunnen lange acquisitietijden in de indirecte dimensie worden gebruikt om de spectrale resolutie te verbeteren en de beperking van de chemische verschuivingsdispersie die inherent is aan IDP’s te verlichten.

PRE is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties, met name interacties die van voorbijgaande of laagbevolkte aard zijn. Een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een NMR-monster dat geschikt is voor het meten van PREs, inclusief stappen voor eiwitzuivering, site-directed spin-etikettering, het opzetten en kalibreren van het pulsprogramma, het verwerken en interpreteren van de NMR-gegevens, wordt verstrekt. Er worden overal belangrijke experimentele overwegingen opgemerkt die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de gegevens en de experimentele resultaten, waaronder de monsterconcentratie, de selectie van het spinlabel en de verwijdering van paramagnetische componenten.