تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لاكتشاف وتوصيف الارتباطات الذاتية للبروتينات المضطربة جوهريا
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتطبيق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي للكشف عن التفاعلات الضعيفة والعابرة بين الجزيئات وداخلها في البروتينات المضطربة جوهريا.
Abstract
تشكل البروتينات المضطربة جوهريا والمناطق المضطربة جوهريا داخل البروتينات جزءا كبيرا ومهما وظيفيا من البروتين البشري. تسمح الطبيعة المرنة للغاية لهذه التسلسلات بتكوين تفاعلات ضعيفة وطويلة المدى وعابرة مع شركاء جزيئيين حيويين متنوعين. تعمل التفاعلات المحددة ذات التقارب المنخفض على تعزيز الارتباط غير المشروع وتمكين جزء واحد مضطرب جوهريا من التفاعل مع العديد من المواقع المستهدفة. بسبب الطبيعة العابرة لهذه التفاعلات ، قد يكون من الصعب توصيفها بطرق البيولوجيا الهيكلية التي تعتمد على البروتينات لتشكيل شكل واحد سائد. يعد الرنين المغناطيسي النووي لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي أداة مفيدة لتحديد وتعريف الأساس الهيكلي للتفاعلات الضعيفة والعابرة. تم وصف بروتوكول مفصل لاستخدام تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لتوصيف مجمعات المواجهة منخفضة السكان التي تتشكل بين البروتينات المضطربة جوهريا وبروتينها أو حمضها النووي أو شركاء جزيئيين حيويين آخرين.
Introduction
يصف الاضطراب الداخلي (ID) البروتينات (IDPs) أو المناطق داخل البروتينات (IDRs) التي لا تطوى تلقائيا في هياكل ثانوية أو ثالثية مستقرة ولكنها نشطة بيولوجيا. بشكل عام ، تتمثل وظيفة IDP / IDRs في تسهيل تفاعلات محددة ولكن قابلة للعكس مع الجزيئات الحيوية في الظروف الفسيولوجية1. وهكذا، يشارك النازحون داخليا والنازحون داخليا في مجموعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تجنيد وتنظيم وتثبيت المجمعات متعددة البروتينات، على سبيل المثال، تجميع ونشاط المركب2، وتجنيد وتنظيم المكونات في مواقع تلف الحمض النووي3، وتنظيم وتثبيت تجنيد معقدات النسخ4، أو معيد تشكيل الكروماتين BAF5. بالإضافة إلى ذلك، يوجد النازحون داخليا في روابط الإشارة حيث تمكنهم اختلاطهم مع شركاء ملزمين مختلفين من التوسط في نقل المعلومات من خلال شبكات البروتين الخلوي6. كما كشفت الأعمال الأخيرة عن ميل مناطق IDR إلى ربط المكثفات الجزيئية الحيوية ذاتية التكوين من خلال عملية فصل الطور السائلعن السائل 7. يعتقد الآن أن العديد من الوظائف المذكورة أعلاه التي تتضمن ID تتضمن بعض جوانب تكوين المكثفات8. على الرغم من أهمية تحديد الهوية للتجميع المعقد الجزيئي الحيوي ، والاستقرار ، والسقالات ، ونقل الإشارات ، يصعب تحديد التفاصيل الذرية لتفاعلاتها المحددة نظرا لأن النازحين داخليا و IDRs عادة ما يكونون غير قابلين للتحقيقات الهيكلية باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد.
الرنين المغناطيسي النووي (NMR) هو تقنية مثالية لفحص الهوية لأنه لا يعتمد على وجود مجموعات هيكلية صلبة أو متجانسة ولكنه يقدم تقارير عن البيئة المحلية المباشرة للنوى الفردية. يتأثر تردد الرنين ، أو التحول الكيميائي ، للنواة في جزيء معين بالمجالات المغناطيسية الضعيفة التي يسببها التوزيع الإلكتروني المحلي ، والذي يعتمد بدوره على أطوال الروابط والزوايا وقرب النوى الأخرى والتفاعلات مع شركاء الربط وعوامل أخرى9. وبالتالي ، تعمل كل نواة كمسبار هيكلي فريد خاص بالموقع حساس للتغيرات في بيئته الكيميائية المحلية. على الرغم من هذه المزايا ، فإن الرنين المغناطيسي النووي هو تقنية سائبة ، والتحول الكيميائي المرصود هو متوسط جميع البيئات التي تم أخذ عينات منها بواسطة نواة معينة. تم تطوير مجموعة من تقنيات الرنين المغناطيسي النووي ، والتي تم وصف العديد منها في هذا العدد ، لاستعادة المعلومات الهيكلية والديناميكية والحركية حول المطابقات الجزيئية الحيوية عالية الطاقة ومنخفضة السكان الموجودة في متوسط التحول الكيميائي10,11. على الرغم من أن هذه الحالات مكتظة بالسكان بشكل عابر ، إلا أن تحديد هذه الحالات وقياسها كميا مهمان لتحديد تفاصيل الآليات الوظيفية12. على سبيل المثال، في حالة النازحين داخليا والنازحين داخليا، قد تكون المجموعة التوافقية متحيزة لأخذ عينات تفضيلية من المطابقات المنتجة لتشكيل مجمعات المواجهة مع شركاء الربط الفسيولوجي. يعد الكشف عن هذه الحالات ، وكذلك تحديد التفاعلات والديناميات الجزيئية الخاصة بالبقايا وداخلها ، أمرا مهما لتحديد الآليات الهيكلية الأساسية لوظيفة البروتين والتكوين المعقد.
تم وصف بروتوكول لاستخدام الرنين المغناطيسي النووي (PRE) لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي (PRE) للتحقيق في الحالات العابرة ذات الكثافة السكانية المنخفضة المهمة لتشكيل المعقدات الجزيئية الحيوية بوساطة IDP / IDR13. هذا النهج مفيد لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين العابرة مثل تلك التي تعزز تجميع ألياف الأميلويد من α-synuclein 14,15 أو الارتباط الذاتي ل FUS16 ، وكذلك لتوصيف تفاعلات البروتين والبروتين المحددة مثل بين بروتينات الإشارة17. يتم تقديم مثال على IDP المرتبط ذاتيا ، حيث تؤدي التفاعلات المحددة بين الجزيئات وداخلها إلى حالات مضغوطة بشكل تفضيلي بالإضافة إلى تفاعلات خاصة بالموقع تدفع الارتباط الذاتي.
ينشأ PRE من التفاعل المغناطيسي ثنائي القطب للنواة إلى مركز مغناطيسي مع موتر g متناحي الخواص ، يتم توفيره عادة في شكل إلكترون غير مزاوج على مجموعة نيتروكسيد أو كذرة فلز بارامغناطيسية18 (الشكل 1). في حين أن الذرات ذات الموترات g-tensors متباينة الخواص تنتج أيضا تأثير PRE ، فإن تحليل هذه الأنظمة يكون أكثر صعوبة بسبب التأثيرات المربكة التي تساهم بها تحولات الاتصال الزائفة (PCS) أو الاقتران ثنائي القطب المتبقي (RDC)13,19. تعتمد قوة التفاعل بين النواة والمركز المغنطيسي على المسافة <r-6> بين الاثنين. ينتج عن هذا التفاعل زيادة في معدلات الاسترخاء النووي ، مما يؤدي إلى توسيع الخط القابل للكشف حتى بالنسبة للتفاعلات طويلة المدى (~ 10-35 Å) ، لأن اللحظة المغناطيسية للإلكترون غير المزاوج قوية جدا20,21. يمكن اكتشاف الحالات العابرة باستخدام PRE إذا تم استيفاء الشرطين التاليين ؛ (1) التفاعل العابر في تبادل سريع على المقياس الزمني للرنين المغناطيسي النووي (التحول الكيميائي المرصود هو متوسط مرجح للسكان لحالات التبادل) ؛ و (2) تكون المسافة بين النوى والمركز المغنطيسي أقصر في الحالة المأهولة بالسكان بشكل عابر منها في الحالة الرئيسية11. يشار إلى PRE المستعرض Γ2 ، ولأغراض عملية ، يتم حسابه من الفرق في معدلات الاسترخاء المستعرض 1H بين عينة تحتوي على مركز مغناطيسي وتحكم مغناطيسي. للحصول على معالجة متعمقة لنظرية PRE وتحولات الاتصال الزائف ذات الصلة في أنظمة التبادل السريع والبطيء ، تتم إحالة القارئ إلى المراجعات الشاملة التي أجراها كلور وزملاؤهفي العمل 13،22. هنا ، يتم النظر فقط في الحالة التي يكون فيها 1H N-Γ2 في نظام التبادل السريع ، حيث بسبب اعتماد r-6 على PRE، يرتبط معدل الاسترخاء الملحوظ بكل من المسافة التي يقترب منها المركز المغنطيسي من النواة وكذلك مقدار الوقت الذي يقضيه في هذا التشكل. لذلك ، فإن المطابقات العابرة التي لا تنطوي على نهج وثيق تنتج PRE صغيرا بينما التفاعلات الأوثق ، حتى لو كانت قصيرة الأجل ، ستنتج PRE.
بالنسبة للنازحين داخليا ، يتم استخدام PRE لقياس وتمييز التفاعلات التي تحدث داخل جزيء واحد (داخل الجزيئات) وبين جزيئات منفصلة (بين الجزيئات). من خلال ربط مركز مغناطيسي ببروتين الرنين المغناطيسي النووي المرئي (على سبيل المثال ، 15N-labeld) أو NMR غير المرئي (على سبيل المثال ، الوفرة الطبيعية 14N) ، يمكن تحديد المصدر (بين أو داخل الجزء) من PRE (الشكل 2). يعد الطفرات الموجهة للموقع والتي تقدم بقايا السيستين طريقة ملائمة لربط مركز مغناطيسي (ملصق مغزلي) ببروتين23. تم اقتراح عدة أنواع من الجزيئات لاستخدامها كعلامات مغزلية ، بما في ذلك مخلب المعادن (القائم على EDTA) والجذور الحرة (القائمة على النيتروكسيد)24. تم وصف العديد من ملصقات دوران النيتروكسيد وهي متوفرة مع كيمياء مختلفة تفاعلية للسيستين مثل ميثانثيوسلفونات وماليميد ويودواسيتاميد25,26 (الشكل 1). قد تكون المرونة المتأصلة في العلامة أو الرابط مشكلة بالنسبة لبعض التحليلات ، وفي هذه الحالات ، تم اقتراح استراتيجيات مختلفة للحد من حركة العلامة ، مثل إضافة مجموعات كيميائية ضخمة أو استخدام رابط ثان لتثبيت العلامة على البروتين (ملحق موقعين)27 ، 28. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتوي العلامات المتاحة تجاريا على بروتينات دياستيرومريك ولكن هذا بشكل عام لن يساهم في PRE29 المرصود. يوصف استخدام 3-Maleimido-PROXYL المرتبط بالسيستين الحر عبر كيمياء ماليميد لأنه متاح بسهولة وفعال من حيث التكلفة وغير قابل للعكس ، ويمكن الحفاظ على عامل الاختزال tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) في المحلول طوال تفاعل وضع العلامات. نظرا لأن 3-Maleimido-PROXYL يحتوي على موتر g متناحي الخواص ، فلا يتم تحفيز PCS أو RDCs ، ويمكن استخدام نفس تخصيصات التحول الكيميائي لكل من العينات المغناطيسية والمغناطيسية13.
يتم قياس 1HN-T 2 باستخدام استراتيجية نقطتين زمنيتين (T a ، Tb) التي ثبت سابقا أنها دقيقة مثل جمع سلسلة تطور كاملة تتكون من 8 إلى 12 نقطة زمنية30. يتم تعيين النقطة الزمنية الأولى (T a) بالقرب من الصفر قدر الإمكاني ، ويعتمد الطول الأمثل للنقطة الزمنية الثانية على حجم أكبر PRE متوقع لعينة معينة ويمكن تقديره من: Tb ~ 1.15 / (R 2، dia + Γ 2) حيث R 2 ، dia يمثل R 2 للعينة المغناطيسية13. إذا كان حجم أكبر PREs غير معروف ، فإن ضبط T b على ~ مرة واحدة في 1H T 2 للبروتين هو تقدير أولي جيد ويتم تحسينه بشكل أكبر عن طريق ضبط T2 لتحسين الإشارة إلى الضوضاء. تقلل استراتيجية القياس المكونة من نقطتين بشكل كبير من الوقت التجريبي اللازم لقياس PREs وتتيح الوقت لمزيد من متوسط الإشارة ، خاصة وأن العينات المخففة نسبيا تستخدم لتقليل آثار الاتصالات غير المحددة بين الجزيئات. يتم استخدام تسلسل النبض القائم على HSQC لقياس 1H N-T2 وقد تم وصفه بالتفصيل في مكان آخر30. لتحسين الحساسية ، يمكن استبدال النبضات الصلبة لعمليات نقل INEPT الأمامية والخلفية بنبضات على شكل ؛ بدلا من ذلك ، يتم تحويل التسلسل بسهولة إلى قراءاتتستند إلى TROSY-based 31. وبما أن النازحين داخليا عادة ما يكون لديهم معدلات استرخاء عرضية أطول بكثير مما يؤدي إلى عرض خط أضيق (بسبب الاضطراب المتأصل) من البروتينات الكروية ذات الحجم المماثل، يمكن استخدام أوقات اكتساب طويلة في البعد غير المباشر لتحسين الاستبانة الطيفية والتخفيف من قيود تشتت التحول الكيميائي المتأصلة في النازحين داخليا.
PRE هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين والحمض النووي ، وخاصة التفاعلات العابرة أو منخفضة السكان. يتم توفير بروتوكول مفصل لإعداد عينة الرنين المغناطيسي النووي المناسبة لقياس PREs ، بما في ذلك خطوات تنقية البروتين ، ووضع العلامات الدورانية الموجهة للموقع ، وإعداد ومعايرة برنامج النبض ، ومعالجة وتفسير بيانات الرنين المغناطيسي النووي. لوحظت اعتبارات تجريبية مهمة في جميع أنحاء والتي قد تؤثر على جودة البيانات والنتائج التجريبية ، بما في ذلك تركيز العينة ، واختيار التسمية المغزلية ، وإزالة المكونات البارامغناطيسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تقديم طريقة لتوصيف التفاعلات العابرة الموجودة في مجموعات منخفضة بين البروتينات المضطربة جوهريا ومختلف شركاء الربط باستخدام PRE. في المثال الموضح، يرتبط البروتين ذاتيا، ومن ثم قد ينشأ PRE من مزيج من التفاعلات بين الجزيئات وداخلها. تمتد هذه الطريقة بسهولة إلى عينات غير متجانسة حيث يمكن تم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة جينفا ينغ وكريستين كانو على المناقشات المفيدة والمساعدة التقنية. DSL هو باحث في سانت بالدريك ويعترف بدعم مؤسسة سانت بالدريك (634706). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة ويلش (AQ-2001-20190330) إلى DSL ، وصندوق Max and Minnie Tomerlin Voelcker (منحة الباحث الشاب لمؤسسة Voelcker إلى DSL) ، وصناديق بدء UTHSA إلى DSL ، وزمالة Greehey Graduate في صحة الأطفال إلى CNJ. يعتمد هذا العمل على الأبحاث التي أجريت في المرافق الأساسية للبيولوجيا الهيكلية ، وهي جزء من مراكز الأبحاث المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو بدعم من مكتب نائب الرئيس للأبحاث والموارد المشتركة لاكتشاف الأدوية والبيولوجيا الهيكلية في مركز ميس للسرطان (NIH P30 CA054174).
Materials
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 – 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al. Intrinsic disorder in transcription factors. Biochemistry. 45 (22), 6873-6888 (2006).
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. . Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. . NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein — site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82 (1), 70-77 (1959).
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
