マウスとヒトの歯からの単一細胞の迅速な分離

すべての動物実験は、国際および現地の規制に従って行われ、チェコ共和国の教育・青少年・スポーツ省によって承認されました(MSMT-8360/2019-2;MSMT-9231/2020-2;MSMT-272/2020-3)。このプロトコルは、雄と雌の野生型C57BL/6およびCD-1マウスと遺伝子組み換えSox10:::iCreERT2 mice17(様々なレポーターシステムと組み合わせた)をC57BL/6バックグラウンドでテストした。ヒトサンプルの実験は、チェコ共和国ブルノにある医学部、マサリック大学ブルノ&セントアンズ教団病院の倫理委員会の承認を得て行われました。 1. 実験的なセットアップとソリューションの準備 計器のセットアップ 遠心分離機を4°Cに冷却します。 インキュベーションチャンバーを37°Cに加熱します。 蛍光活性化セルソーティング(FACS)マシンを起動し、ソーター(コレクションチューブホルダを含む)のすべての温度を4°Cに設定します。 機器の品質管理を行い、ドロップ遅延を設定します。 事前のギャティング戦略を設定し、テストのソートを実行します。注: FACS を使用する場合は、100 μm のノズルを使用してください。 ソリューションを準備します(手順1.2.1-1.2.3)。 洗浄液:HBSS(ハンクスのバランス塩溶液)で新鮮な2S(牛血清)を準備します。 消化混合物:フレッシュコラゲナーゼP(3 U/mL)をHBSSに完全に溶解させて準備します。 オプション: 単細胞懸濁液を-80 °Cで保存するために、フレッシュHBSS + BSA (0.04%)と冷蔵分析グレードのメタノールを-20 °C冷凍庫で準備します。注: 実験を開始する前に、ステップ 1 を実行する必要があります。利用された溶液の組成は 補足表1にまとめた。 2. 実験動物・歯の準備 実験動物(マウス)を準備する。 現地の規則に従ってマウスを安楽死させる。例えば、麻酔薬による過剰摂取は、前述のとおり1.注意:実験動物の人道的安楽死に関する規制は、局所的に異なります。常に有効な現地の規制に従ってください。 直ちに組織解剖工程(ステップ3)に進む。注:実験動物の組織を直ちに解剖できない場合(例えば、動物の住施設からの移動など)、実験動物を氷の上に置き、できるだけ早く組織解剖を行う。マウスモルパルプからより多くの細胞を得るために、若い(6週間以下)動物を使用する。年齢が増加すると、歯科パルプのサイズが小さくなります。マウスの切歯は、主に年齢の増加に伴って構造を維持するので、様々な年齢の動物が組織解剖に使用することができます。 人間の歯を準備する注:人間の歯は、臨床的に関連する理由のために抽出されました。すべての診断は個別に治療され、経験豊富な歯科外科医は常に抜歯を行った。 抽出した歯をすぐに氷冷HBSSで50mLチューブに入れ、さらに処理されるまでチューブを氷の上に置きます。注:最高の細胞収量のために25-30歳まで患者からの保持された親知らずを使用することをお勧めします。 3. 組織解剖 実験動物の頭の後ろに持ち、尾が離れて指し出るように頭の腹側を見てください。 小さくて鋭いはさみを使用して、下顎骨のアーチ、下顎骨の各半分の間の軟部組織、および隣接する顔の筋肉を露出させるために、すぐに下顎骨から皮膚を取り除く。 下顎の両側から深いカットを行います。まず、顎関節までの下顎骨側のバッカル側に沿ってm.マッセターを通り、次に口腔の基部を通って下顎骨の各半分の内側に沿って( 補足図1を参照)。 口腔の外側と内側の両方から顎関節まで下顎骨に沿ってすべての筋肉と靭帯を切断します。注: ボーンを切断しないでください。これは、切歯の最もアプリカル部分を損傷する可能性があります。 曲がった先端ピンセットを使用して下顎を握り、それを取り除きます。次に、解剖した下顎骨を下顎骨共生を切断して、はさみで2つの半分に分割します( 補足図1を参照)。 工業用低糸口ワイプを使用して、下顎骨の各半分から残りの軟部組織を切り落とします。下顎の両方の部分を洗浄した後、氷冷HBSSで事前に準備されたペトリ皿に入れます。注:この時点から、氷の上で作業してください。マウスの切歯および臼歯の更なる解剖は、黒い背景を有する実体顕微鏡下で行われる。 マウス下顎切歯 下顎切歯の解剖のために、3つの大臼歯すべてを持つ歯槽尾根を取り除き、第1モルと第2のモルの間の位置に対応する場所で下顎弓を横切って割る。注:鋭いメスの刃の11とピンセットは、このステップを実行するために使用されます( 材料表を参照)。 歯ソケットの残りの部分から慎重に切歯を引き出します。注:成功した場合、抽出された切歯は完全な頸部ループを有する上皮組織を含む無傷の尖壁部分を含む。 必要に応じて、ピンセットとメスで切り傷に付着した骨の残りの断片を除去します。 解剖した切歯を新鮮な氷冷HBSSに入れ、子宮頸部ループ、歯髄、または歯の他の部分など、目的の組織を解剖します。 解剖した軟組織を、10cmのペトリ皿の真ん中に新鮮な氷冷HBSSの液滴に入れます。氷の上に置いておきなさい。 マウス下顎臼歯 下顎臼歯を解剖するために、メスの刃を使用して下顎骨の残りの部分から歯槽尾根を完全に取り除きます。 解剖された歯槽の紋章をペトリ皿の新鮮な氷冷HBSSに移動し、根に取り付けられた歯槽骨の残りの断片をすべて慎重に取り除きます。 歯槽の骨のない解剖した臼歯を新鮮で氷冷HBSSに入れる。パルプを露出するには、パルプキャビティに到達するまで、細かい鋭利な先端ピンセットを使用して、象牙質側から象牙質の一部を取り除き始めます。 パルプ腔に達したら、鋭い先端ピンセットを使用して歯科パルプを慎重に解剖し、歯髄の軟部組織を氷の上に保管された10cmペトリ皿の真ん中に新鮮で氷冷HBSSの液滴に入れます。注:マウスの大臼歯のパルプは非常に小さいので、それに応じて実体顕微鏡で倍率を調整してください。 人間の歯 氷冷HBSSでもう一度人間の歯を洗い、残りの血液を取り除きます。 歯を3つの厚い壁の無菌プラスチック袋に入れ、鋳鉄製のベンチトップエンジニアのバイスを使って歯を割ります。袋を貫通しないように、平らな表面を持つバイス顎を使用してください。 歯の割れが聞こえるまで、ゆっくりと万力を締めます。袋から取り出し、ペトリ皿の新鮮な氷冷HBSSに入れます。 2つのピンセットを使用して、歯科パルプを取り出し、硬い組織のすべての残骸からそれをきれいにし、氷の上に保管された10cmペトリ皿の真ん中に氷冷HBSSの1液滴に入れます。注意:人間の組織は感染する可能性があります。人間の組織を扱うときは、組織との直接接触を避けるために保護装置を使用してください。 4. 単細胞懸濁液の調製 15 mL チューブを用意し、2.5 mL の消化液を HBSS に完全に溶解したコラゲローゼ P (3 U/mL) で構成します。使用するまで氷の上にソリューションを保管してください。注:常に作りたてのコラゲラーゼPを使用してください。アリコートを凍結しないでください。コラゲラーゼP活性はバッチからバッチまで異なります。希釈する前に、バッチのアクティビティを確認してください。コラゲナーゼPはカルシウムによって活性化され、その量は既に凍結乾燥粉末で十分である。そのため、カルシウムとの酵素混合を豊かにする必要がなくなります。コラゲターゼPはFBSによって不活性化されないが、キレート剤(例えば、エチレンジアミントラセクティック−EDTA)によって不活性化され得る。解離プロセスを停止すると、ラコラーゼPを洗浄液(HBSSで2S)で希釈することによって確実に行われます。FBSを追加すると、細胞の生存率が増加し、並べ替え後の最終的な数の細胞数が18に増加することが示されています。 丸い形のメスの刃を10番にして、組織を全方向に切り取って、出来る限り小さくする。液滴の中央に組織片を再凝集し、丸型(No.10)メスの刃を使用して組織凝集体を繰り返し切断する。材料が十分にみじん切りになるまで、このプロセスを数回繰り返します。 1 mL ピペットチップを使用して、細断された組織片を準備した消化液に移します。注:一度に処理されている動物の数が多い場合は、コラゲナーゼPでいくつかのチューブに組織を分割します。チューブ当たりの最大量は、約10個のマウス切歯から得られるパルプです。パルプが非常に少ない大臼歯の場合、加工パルプの数を十分に増やすことができます。人間の歯を使用する場合は、パルプのサイズに応じて、チューブあたり最大2〜3個のパルプを使用してください。 37°Cの予熱インキュベーターに、シェーカーでチューブを入れます。シェーカー内のチューブを60°の角度に傾け、チューブ内の一定のサスペンションの動きを確実にするために速度を150〜200rpmに設定します。 すべての塊を崩壊させるために1 mLピペットチップで3〜4分ごとに懸濁液を激しくトリチュレートします。注:時間が経つと、塊はほとんど消えるまで小さく、柔らかくなります。 合計で、15〜20分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、最後にトリチュレートし、最後の体積12mLに氷冷洗浄液をゆっくりと加えます。 50 μmの細胞ストレーナーを使用して懸濁液を濾過して、残りの塊または石灰化組織の破片を取り除きます。 濾過細胞懸濁液の10〜20 μLを取り、細胞計数チャンバー(ヘモサイトメーター)を使用して遠心分離中に細胞を数えます。遠心分離機は4°Cで300xgで5分間 10 mL血清ピペットを使用して上清を取り除く。注: 希釈された懸濁液でカウントできないセル数が制限されている場合は、セルカウントをスキップし、すべてのセルを使用して処理を続行します。 オプション: 固定およびストレージ21に進みます。 HBSS + BSA (0.04%)の100 uLにペレット(最大107 細胞)を再懸濁します。 冷やしたメタノールを400μL加え、ゆっくりと混ぜます。 細胞懸濁液を氷の上で15分間インキュベートします。 処理されるまで-80°Cで保管してください(1ヶ月以内)。 洗浄液中のペレットを再び懸濁します。洗浄液の700-1200細胞/μLを目指します。 さらに処理されるまでチューブを氷の上に置いてください。注:必要に応じて、-80°Cで固定および保管を行ってください。 しかし、scRNA-seqに対する細胞懸濁液の即時処理が推奨される。さらなるステップは、単一細胞RNA seqプロトコルに依存する。scRNA-seq プロトコルがマイクロ流体システムを使用する場合 (いくつかの sc-RNA-seq 企業が行います)、直接または細胞の並べ替え後に、メーカーのガイドラインに基づいてセルをロードします。 FACS の場合は、手順 5 に進みます。 5. 蛍光活性化細胞分類(FACS) ソートする前に、セルソート器を準備します。 システム全体を4°Cに冷却し、機器の品質管理を行い、落下遅延と偏向プレートの電圧を設定します。コレクションチューブをコレクションチューブホルダーに入れます。注:不要な細胞損失をもたらす追加の遠心分離ステップを避けるために、洗浄液の少量(25〜50 μL)のマイクロチューブ(1.5 mL)に細胞を分類します。 オプション: FACS の前に生存率染色を実行します。 FACSの前にヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に加え、最終濃度0.5μg/mLにし、4°Cで15分間インキュベートします。 サンプルをセルソーターにロードします。細胞の破片、ダブレット、死んだ細胞を除去するための厳格な格言戦略を設定します。細胞を準備チューブまたはマルチウェルプレートにソートします。図 2 に、ゲージ戦略の例を示します。注: 操作手順を最小限に抑え、プロトコルを高速化するには、実行可能性染色を使用するのではなく、厳密な格言戦略 ( 図 2 で推奨) を適用することをお勧めします。免疫細胞を単離集団から分離するために、CD45抗体染色を行うことができる。これを行うために、細胞懸濁液を100μLの染色溶液(PBS+ 2S + 抗CD45-APC共役抗体1/100希釈)で再懸濁させる。光から保護された氷上で15分間インキュベートし、FACSを直接実行します。