العزل السريع للخلايا المفردة من الفأر والأسنان البشرية
Summary
يقدم البروتوكول الحالي طريقة سريعة وفعالة ولطيفة لعزل الخلايا المفردة المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قاطع الماوس المتنامي باستمرار ، وضرس الماوس ، والأسنان البشرية.
Abstract
تمثل الأسنان الماوسة والبشرية أعضاء صعبة لعزل الخلايا بسرعة وكفاءة للنسخ أحادي الخلية أو التطبيقات الأخرى. أنسجة لب الأسنان، غنية في مصفوفة خارج الخلية، يتطلب عملية تفكك طويلة ومملة التي عادة ما تكون وراء الوقت المعقول لn transcriptomics خلية واحدة. لتجنب التغيرات الاصطناعية في التعبير الجيني ، انقضى الوقت من القتل الرحيم حتى تحليل الخلايا المفردة يحتاج إلى تقليل. يقدم هذا العمل بروتوكول سريع يمكن من الحصول على تعليق خلية واحدة من الماوس والأسنان البشرية في نوعية ممتازة مناسبة لscRNA-seq (RNA-تسلسل خلية واحدة). ويستند هذا البروتوكول على خطوات عزل الأنسجة المتسارعة، والهضم الأنزيمي، والتحضير اللاحق للتعليق النهائي للخلية الواحدة. وهذا يتيح المعالجة السريعة واللطيفة للأنسجة ويسمح باستخدام المزيد من العينات الحيوانية أو البشرية للحصول على تعليق الخلايا مع قابلية عالية للحياة والحد الأدنى من التغييرات النسخية. ومن المتوقع أن هذا البروتوكول قد توجه الباحثين المهتمين في أداء scRNA-seq ليس فقط على الماوس أو الأسنان البشرية ولكن أيضا على الأنسجة الأخرى الغنية بالمصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك الغضاريف والأنسجة الضامة الكثيفة والأدمة.
Introduction
تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية هو أداة قوية لفك رموز في بنية سكان الخلية الحية، والتسلسل الهرمي، والتفاعلات، و homeostasis1،2. ومع ذلك ، تعتمد نتائجها بقوة على الخطوة الأولى من هذا التحليل المتقدم – إعداد تعليق خلية واحدة ذات جودة مثالية من الأنسجة المعقدة والمنظمة تنظيما جيدا. ويشمل ذلك إبقاء الخلايا على قيد الحياة ومنع التغيرات الاصطناعية غير المرغوب فيها في ملامح التعبير الجيني للخلايا3,4. وقد تؤدي هذه التغييرات إلى توصيف غير دقيق للهيكل السكاني وسوء تفسير البيانات المجمعة.
وقد وضعت بروتوكولات محددة لعزل مجموعة واسعة من الأنسجة 5,6,7,8. وعادة ما تستخدم التفكك الميكانيكي في تركيبة مع مزيد من الحضانة مع مختلف الإنزيمات البروتيوليك. وتشمل هذه عادة التريبسين، collagenases، dispases، papain6، 7،8،9، أو خليط الانزيم المتاحة تجاريا مثل أكوتاسي، تريبل، الخ.5. الجزء الأكثر أهمية التي تؤثر على جودة النسخ هو الهضم الأنزيمي. وتبين أن الحضانة المطولة بالإنزيمات عند 37 درجة مئوية تؤثر على التعبير الجيني وتسبب في تنظيم العديد من الجينات المرتبطة بالإجهاد10,11,12,13. المعلمة الحاسمة الأخرى لعملية العزل هي طولها الإجمالي ، حيث ثبت أن نسخ الخلايا تتغير بعد نقص التروية في الأنسجة14. يقدم هذا البروتوكول بروتوكولا فعالا للعزل اللطيف للخلايا المفردة عن الأسنان البشرية والفأرة ، أسرع من البروتوكولات الأخرى المستخدمة سابقا لعزل الخلايا عن الأنسجة المعقدة5،6،9،11،13،15،16.
يقدم هذا البروتوكول كيفية تشريح الأنسجة الرخوة بسرعة من الأسنان الصلبة وإعداد تعليق خلية واحدة مناسبة لscRNA-seq. تستخدم هذه الطريقة خطوة واحدة فقط للطرد المركزي وتقلل من تأثير التغييرات النسخية غير المرغوب فيها عن طريق تقليل وقت التعامل مع الأنسجة والهضم والحفاظ على الأنسجة والخلايا عند 4 درجة مئوية معظم الوقت. يعرض الإجراء عزل الخلايا من قواطع الماوس والضرس وأسنان العقل البشري كمثال ، ولكن يجب أن يعمل بشكل أساسي لأسنان أخرى في كائنات حية مختلفة. يتم تصور البروتوكول الكامل تخطيطيا في الشكل 1. وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا لتوليد أطلس نوع خلية الأسنان التي تم الحصول عليها من الماوس والأسنان البشرية1.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة الأسنان والعظام على المستوى الخلوي أو الجزيئي هو التحدي عموما منذ الخلايا التي تشكل هذه الأنسجة محاطة أنواع مختلفة من المصفوفات الصلبة19. واحدة من الأهداف الرئيسية لأداء RNA-seq خلية واحدة على أنسجة الأسنان هو الحاجة إلى الحصول على خلايا ذات أهمية سريعة ودون أي تغييرات مصطنعة في النسخ الخاصة بهم. ولتحقيق ذلك، تم تطوير بروتوكول عالي الكفاءة مناسب لعزل الخلايا عن لب الأسنان البشرية والفأرة، والذي يسمح بالتوليد السريع للتعليق أحادي الخلية لجميع التطبيقات النسخية. وقد تم ضمان ذلك عن طريق عزل الأنسجة بسرعة، وتقليل خطوات التلاعب بالأنسجة والخلايا، وتبسيط الهضم الميكانيكي والانزيمي.
أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي المعالجة السريعة للأنسجة وإعداد تعليق الخلايا المفردة الكافي8,9. يتم استخدام نهج يدوي للحصول على لب الأسنان دون استخدام مثقاب الأسنان أو غيرها من الأجهزة المولدة للحرارة. قد يسبب ارتفاع درجة الحرارة تعبيرا اصطناعيا عن بروتينات الصدمة الحرارية والجينات الأخرى ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى أن تكون أنماط التعبير الجينية التي تم تحليلها غير تمثيلية للأنسجة الأصلية20. قد يكون الحصاد اليدوي للأنسجة خطوة صعبة من المرجح أن تحتاج إلى بعض التدريب مسبقا. ثم يقطع اللب إلى قطع صغيرة ويهضم بشكل أنزيمي عند 37 درجة مئوية. باستثناء 15-20 دقيقة من الهضم الأنزيمي ، يتم تنفيذ البروتوكول بأكمله عند 4 درجات مئوية. تم تقليل معالجة الأنسجة وخاصة الهضم الأنزيمي إلى أقصر وقت ممكن لأن الحضانة الأكثر طولا عند 37 درجة مئوية يمكن أن تسبب تغييرات في أنماط التعبير الجيني10. يوصى بإزالة الدنتين ميكانيكيا قبل الهضم الأنزيمي. يحتوي دينتين والبردينتين المرفق بالب على كمية كبيرة من الكولاجين ، وقد يقلل وجوده المفرط من فعالية محلول الهضم. بعد إزالتها من الجسم (أو موت الكائنات الحية) ، تبين أن الخلايا تبدأ في تعديل أنماط التعبير الجيني بسرعة12. لذلك، يجب إجراء عزل الخلايا ومعالجتها في أسرع وقت ممكن. البروتوكول الحالي يقلل من وقت المعالجة إلى 35-45 دقيقة من عزل الأنسجة (القتل الرحيم الحيوان) لإعداد تعليق خلية واحدة.
تعديل بديل واحد من هذه التقنية هو الحفاظ على الخلية لاستخدامها في وقت لاحق. ويتحقق ذلك عن طريق تثبيت الميثانول. يمكن تخزين تعليق الخلية الثابتة الميثانول لمدة تصل إلى 1 شهر في -80 درجة مئوية، كما هو موضح في protocol21. ومع ذلك، كلما كان ذلك ممكنا، أداء scRNA-seq مباشرة، حيث تبين أن البيانات ذات الخلية الواحدة من تعليق خلية واحدة ثابتة الميثانول قد تعاني من زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة بالإجهاد والتلوث مع الحمض النووي الريبي المحيط 22. قد تحتاج هذه الخطوة إلى تعديل إضافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
قبل التطبيق الأول من هذا البروتوكول، ينصح بإجراء عدة خطوات التحقق من الصحة لاختبار هذه التقنية. ومن تجربتنا، نقترح اختبار الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه للبروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، نقترح اختبار فعالية محلول Collagenase P واختبار التعامل مع خطوة تفكك الأنسجة. على وجه التحديد، حول أول 5 دقائق بعد بدء حضانة كولاجيناز P، يجب أن تتجمع قطع الأنسجة معا. وهذا وضع شائع. تتفكك المجاميع كل 3-4 دقائق باستخدام ماصة 1 مل ، ومع زيادة الوقت ، يجب أن تصبح أصغر حتى بالكاد مرئية.
وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن إجراء عد الخلايا في غرفة عد الخلايا قبل الطرد المركزي وقبل وبعد التصفية للكشف عن الخسائر المحتملة في الخلايا بسبب إزالة الخلايا الفائقة دون المستوى الأمثل. إذا كان التعليق النهائي أحادي الخلية يحتاج إلى تنقية، يمكن استخدام FACS. فرز الخلية لا تمكن فقط لإزالة الحطام أو الخلايا الميتة ولكن الأهم من ذلك تمكن من إثراء التعليق النهائي مع الخلايا المسمى fluorescently13,19. لتجنب إجهاد القص أو انسداد مفرز الخلية، يتم استخدام فوهة واسعة (85 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر). وهذا من شأنه أن يزيد من تحسين صلاحية الخلايا المفرزة.
تم تصميم هذه التقنية واختبارها على كل من الماوس والأسنان البشرية. العامل الرئيسي المقيد هو العدد الصغير من الخلايا في لب الأسنان المنخفض لأسنان الفئران الأكبر سنا (الأضراس) والبشر. لنفترض أن هناك عدد أكبر من الخلايا التي تحتاج إلى الحصول عليها أو الخلايا من أسنان المرضى الأكبر سنا هي التي يتعين الحصول عليها. أحد الحلول الممكنة هو معالجة عدد أكبر من الأسنان ودمجها في دفعة واحدة ، تتم معالجتها لاحقا كعينة واحدة.
تم عزل الخلايا الحية من لب الأسنان البشري لأول مرة منذ أكثر من عشرين عاما باستخدام خليط إنزيم من الكولاجيناز الأول وdispase23. ومنذ ذلك الحين، أصبحت عزلات خلايا لب الأسنان تستخدم على نطاق واسع، واستخدمت عدة تقنيات 5،6،7،8. الأهمية الحاسمة للطريقة المعروضة هنا هو التكيف من جميع خطوات العزل لجعل العزلة سريعة ولطيفة لضمان جودة عالية من تعليق الخلية النهائي لscRNA-seq. يمكن الحصول على زيادة غلة الخلايا عن طريق الحضانة لفترات أطول مع الإنزيمات. يوفر هذا البروتوكول حلا فعالا للحصول بسرعة على خلايا واحدة من الماوس والأسنان البشرية ذات جودة مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. ومن المتوقع أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى مع تعديلات تقنية طفيفة فقط.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
حصل ج. ك. على دعم وكالة المنح بجامعة ماساريك (MUNI/H/1615/2018) وبأموال من كلية الطب إلى باحث مبتدئ. وقد تم دعم J.L. من قبل وكالة المنح في جامعة ماساريك ( MUNI / IGA / 1532/2020) وهو حاصل على منحة Brno Phd. Talent – بتمويل من بلدية مدينة برنو. T.B. كان مدعوما من قبل صندوق العلوم النمساوي (منحة ليز ميتنر: M2688-B28). نشكر ليدي إيزاكوفيتشوفا هولا وفيرونيكا كوفار ماتيوفا على مساعدتهما في الحصول على أسنان بشرية. وأخيرا، نشكر راديك فيدر وكاريل سوسيك على مساعدتهما الرقيقة في فرز ال FACS.
Materials
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 – Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O’Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
