Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Дифракция электронов через 2D-кристаллы или спиральные массивы белков может достигать субнанометровых разрешений в благоприятных случаях^1,2,3. Особый интерес представляют восстановленные 2D мембранные белковые массивы или кристаллы в их почти нативных средах^1. Поскольку кристалл действует как усилитель сигнала, усиливая интенсивность структурных факторов на определенных пространственных частотах, электронная кристаллография позволяет зондирование мишени с меньшим размером при высоких разрешениях, таких как малые молекулы, чем для крио-ЭМ с одной частицей. Электронный пучок может быть дифрагирован упорядоченным 2D-массивом белков, генерируя дифракционную картину или изображение решетки в зависимости от того, где плоскость изображения записывается на^{детекторе 4.} Затем дифракционные интенсивности могут быть извлечены и обработаны для реконструкции 2D-проекционной структуры кристалла. Электроны имеют большее поперечное сечение рассеяния, чем рентгеновские лучи, и его рассеяние в основном следует модели Резерфорда, основанной на кулоновском взаимодействии между электронами и заряженными атомами в молекуле^5. Толщина 2D мембранных кристаллов обычно составляет менее 100 нм, пригодных для передачи электронов без динамического рассеяния, происходящего в образце^6. Было показано, что электронно-кристаллографические исследования можно использовать мощный инструмент для исследования структурной информации с высоким разрешением мембранных белков илипидно-белковых взаимодействий^7,8,9,10,^{11, 12,13,14,15,16,17.}

Монослой липидов представляет собой один единственный липидный слой, состоящий из фосфолипидов, плотно упакованных на границе^{раздела 6}воздух-вода, который может способствовать образованию 2D-массива для растворимых белков или белков периферических мембран^18. В зависимости от плотности липидов и их бокового давления молекулы липидов могут образовывать упорядоченный 2D-массив на границе раздела воздух-вода с их ацильными цепями, расширенными до воздуха и гидрофильных головных групп, выставленных в водном^{растворе1,6,19.} Липидная головная группа может взаимодействовать с белками посредством электростатического взаимодействия или может быть модифицирована для обеспечения метки сродства для связывания определенного белкового домена. Например, DOGS-NTA-Ni (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота)сукцинил]2-Ni²⁺⁾часто используется при формировании липидного монослоя для связывания белков с полигистидовой меткой ^20,21,22. Также холерный токсин В может связывать определенный пентасахарид ганглиозида GM1 в липидном монослое для структурных исследований^23,24. Закрепляя белки на липидных головных группах, липидный монослой может способствовать формированию 2D-массивов, которые являются тонкими для электронно-кристаллографических исследований с высоким разрешением. Липидный монослойный метод был использован в электронной кристаллографии для структурных исследований белков, таких как стрептавидин^2,25,аннексин V^26,холерический токсин^27, E. coli gyrase B субъединица^28, E. coli РНК-полимераза^25,29,30,белки оболочки карбоксисомы³¹ и капсидные белки ВИРУСА ВИЧ-1³² и вируса ^{мышиного лейкоза Молони 33.}Из-за стабильности и химических свойств липидного монослоя были исследованы различные применения для подготовки образцов для крио-ЭМ-визуализации^34. Однако для формирования белкового массива потребуется оптимизация.

Здесь мы предоставляем подробные сведения об общей подготовке липидных монослоев для крио-ЭМ-визуализации и некоторые соображения, которые могут повлиять на качество образующихся монослоев.