הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים
Summary
שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.
Abstract
קריסטלוגרפיה אלקטרונית היא כלי רב עוצמה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה. מקרומולקולים כגון חלבונים מסיסים או ממברנה ניתן לגדל גבישים דו ממדיים מסודרים מאוד (2D) בתנאים נוחים. איכות הגבישים הדו-מימדיים הגדלים חיונית לרזולוציה של השחזור הסופי באמצעות עיבוד תמונה דו-מימדית. במהלך השנים, monolayers השומנים שימשו שכבה תומכת כדי לטפח את התגבשות 2D של חלבונים ממברנה היקפית, כמו גם חלבונים מסיסים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על התגבשות דו-צדדית של חלבונים ממברנה אינטגרליים, אך דורשת חקירה אמפירית נרחבת יותר כדי לקבוע תנאי דטרגנט ודיאליזה כדי לקדם חלוקה למונו-שכבתית. מונולייר שומנים נוצר בממשק מי האוויר כך שקבוצות ראש השומנים הקוטביות נשארות לחות בשלב מימי ושרשראות אציל שאינן קוטביות, זנבות המחיצות לאוויר, שוברות את מתח פני השטח ומשתחות את פני המים. הטבע הטעון או moieties כימי ייחודי של קבוצות הראש לספק זיקה חלבונים בתמיסה, קידום כריכה להיווצרות מערך 2D. ניתן להעביר בקלות מנובייה חדשים עם מערך דו-ממדי למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על רשת נחושת מצופה פחמן המשמשת להרמה ותמיכה במערך הגבישי. בעבודה זו, אנו מתארים מתודולוגיית חד שכבתית שומנים עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM).
Introduction
עקיפה אלקטרונית באמצעות גבישים דו-ממדיים או מערכים שליים של חלבונים יכולה להשיג רזולוציות תת-ננומטר במקרים חיוביים1,2,3. עניין מיוחד הם reconsuted 2D קרום חלבונים מערכים או גבישים בסביבות הקרובות שלהם1. מכיוון שמגבר אות פועל כמגבר אותות המגביר את עוצמות הגורמים המבניים בתדרים מרחביים ספציפיים, קריסטלוגרפיה אלקטרונית מאפשרת לבחן מטרה בגודל קטן יותר ברזולוציות גבוהות, כגון מולקולות קטנות, מאשר אלה של קריו-EM של חלקיק יחיד. קרן האלקטרונים יכולה להיות מפוזרת על ידי מערך דו-ממדי מסודר של חלבונים, יצירת תבנית עקיפה או תמונת סריג בהתאם למקום שבו מישור התמונה נרשם בגלאי4. לאחר מכן ניתן לחלץ ולעבד את עוצמות ההקרנה הדו-ממדיות כדי לשחזר מבנה הקרנה דו-ממדי של הגביש. אלקטרונים יש חתך פיזור גדול יותר מאשר צילומי רנטגן ופיזורו בעיקר בעקבות מודל רתרפורד המבוסס על אינטראקציית קולון בין האלקטרונים לבין האטומים הטעונים במולקולה5. העוביים של גבישי ממברנה 2D הם בדרך כלל פחות מ 100 ננומטר, מתאים להעברת אלקטרונים ללא פיזור דינמי המתרחש בתוך דגימה6. מחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים הוכחו ככלי רב עוצמה לחקור מידע מבני ברזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה ואינטראקציות חלבון שומנים7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
חד-שכבתית היא שכבה אחת של שומנים המורכבת מפוספוליפידים ארוזים בצפיפות בממשק מי אוויר6, אשר יכול לסייע היווצרות מערך 2D עבור חלבונים מסיסים או חלבונים ממברנה היקפית18. בהתאם לצפיפות השומנים והלחץ הרוחב שלהם, מולקולות השומנים יכולות ליצור מערך 2D מסודר בממשק מי האוויר עם שרשראות האציל שלהם המורחבות לאוויר וקבוצות ראש הידרופיליות שנחשפו בתמיסה מימית1,6,19. קבוצת הראש של השומנים יכולה לקיים אינטראקציה עם חלבונים באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית או שניתן לשנות אותה כדי לספק תג זיקה כדי לקשור תחום חלבון מסוים. לדוגמה, כלבים-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-גלייצרו-3-[(N-(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל)חומצה ימינודיקטית)סוצ’יניל]2- Ni2+) משמש לעתים קרובות ליצירת מונולייר שומנים כדי לקשור את החלבונים עם תג פולי-היסטידין20,21,22. כמו כן, רעלן כולרה B יכול לקשור פנטסקכריד מסוים של ganglioside GM1 ב monolayer שומנים למחקרים מבניים23,24. על ידי עיגון החלבונים על קבוצות הראש של השומנים, monolayer השומנים יכול לסייע בהיווצרות של מערכים 2D כי הם דקים עבור מחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. טכניקת חד שכבתית השומנים שימשה בקריסטלוגרפיה אלקטרונית למחקרים מבניים של חלבונים, כגון סטרפטאבידין2,25, annexin V26, רעלן כולרה27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA פולימראז25,29,30, חלבוני קליפה קרבוקסיתום31 וחלבוני קבסיד של נגיף ה- HIV-1 1 32 ומולוני מורין לוקמיה 33.בשל היציבות והרכוש הכימי של monolayer השומנים, יישומים שונים להכנת מדגם נחקרו עבור הדמיה cryo-EM34. עם זאת, יהיה צורך באופטימיזציה להיווצרות מערך חלבונים.
כאן, אנו מספקים פרטים נרחבים על ההכנה הכללית של monolayers השומנים עבור הדמיה cryo-EM וכמה שיקולים שיכולים להשפיע על איכות monolayers שנוצר.
Protocol
Representative Results
Discussion
monolayer שומנים הוא כלי רב עוצמה המאפשר את הצמיחה של גבישים 2D גדולים למחקרים מבניים של macromolecules ביולוגי. כדי להכין בהצלחה monolayer שומנים שלם בממשק מי האוויר, מומלץ מאוד כי השומנים מוכנים טרי ביום הניסוי, כי חמצון של שרשרת סיל השומנים יכול להוביל שיבוש אריזה monolayer להשפיע לרעה על היווצרות הגביש המת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הכנת כתב יד זה נתמכה חלקית על ידי משרד המחקר של צבא ארה”ב (W911NF2010321) וקרנות ההפעלה של אוניברסיטת אריזונה ל- P.-L.C.
Materials
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
- Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
- Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
- Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
- Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
- Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
- Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
- Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
- Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
- Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
- Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
- Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
- Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
- Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
- Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
- Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
- Pal, S. Chapter 6 – Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
- Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
- Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
- Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
- Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L’Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
- Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
- Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
- Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
- Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
- Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
- Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
- Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
- Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
- Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
- Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
- Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
- Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
- Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
- Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
- Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
- De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
- Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
- Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
- Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
- Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).
