コンピューター断層撮影ベースの3次元可視化のサンプル調製

全ての手続きは熊本大学動物ケアガイドライン(承認参照番号)に従って実施した。M30-040/A2020-105)は、米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(出版第85-23号、2011年改訂)に準拠しています。 1. 準備 灌流装置および血管拡張剤緩衝液(4mg/Lパパベリン塩酸塩、4 g/L;アデノシン、1 g/L;ヘパリン、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 U/mL)を準備する。注:還流装置および血管拡張薬は、Weyersらら5によって報告されたものと同じです。 22 G カテーテル、2 mL 延長チューブ、および 3 方向ストップコックを接続します(図 1A)。注意:動物のサイズに合わせてゲージを調整します。成体C57BL/6マウスの場合、22Gが最適である。 血管拡張剤バッファーで圧力灌流装置を充填します(図1A)。注:泡の形成を避けて、コントラスト媒体の充填の中断を防ぎます。 2. 灌流 手術の30分前にPBSに1 U/gヘパリンを注入します。 イオブルランでマウスを完全に麻酔し、頸部脱臼によって安楽死させる。 切断後、胸骨に正中線切開を行い、開いた胸郭をピンで固定します。注:コントラストの漏れを避けるために、ダイヤフラムを傷つけることは避けてください。 上が大大小を切り、心臓を取り除きます。 肺を取り除き、下降大起を露出する。注:下降大大痛を傷つないでください。 下り大動脈を斜めに切り、断面を露出します(図1B)。メモ:大間は剥がさないで下してください。対角断面はカテーテル挿入に適しています。 血管拡張バッファーを実行しながら、下降大陸に22 Gカテーテルを挿入します。注:血管拡張バッファーを実行している間にカテーテルを挿入すると、空気汚染を回避できます。 カテーテルの根をピン留めします(図1C)。 逆流による漏れを防ぐために結び目を作ります。 温めた血管拡張溶液(パパベリン塩酸塩、4 g/L;アデノシン、1 g/L;ヘパリン、1 U/mL)を13~15kPaの固定圧で3分間浸透させる。 4%パラホルムアルデヒド(PBS)中の溶液を3分間浸透させます。メモ:固定の成功は足の動きによって確認できます(図1D)。 灌流直前にコントラスト培地を用意します。注:サンプルに応じて希釈速度を調整します。成体マウスの場合、1:1の比率で染色と希釈剤を混ぜます。 灌流を停止し、希釈されたコントラスト媒体の2 mLで延長管を充填します(図1E)。注:造影剤は血管への傷害を避けるためにゆっくりと注入されるべきである。 13~15kPaの固定圧でコントラスト媒体を浸透させます。 動脈を可視化するには、足の爪を調べて、コントラスト媒体が動脈に到達したことを確認します(図1F)。 すべての血管を可視化するには、ダイヤフラムの下の大静脈をチェックして、コントラスト媒体の完全な循環を確認します。注: 最初は、コントラストには血管拡張ソリューションが含まれています。したがって、その適切な循環は不可欠です。 3方向のストップコックを閉じ、チューブを取り外します(図1G)。注: 3 方向ストップコックが閉じていない場合、コントラストは逆方向に流れます。 サンプルを4°Cで一晩インキュベートする。 皮膚を取り除き、10%ホルムアルデヒド溶液に固定します。 3. 可視化 注: 可視化プロトコルは、CTスキャナによって異なります。このプロトコルではマイクロフォーカスX線CTスキャナが使用されました。各CTスキャナに応じて撮像方法を最適化する必要があります。 PBSを含む50 mLチューブにサンプルを固定します。 サンプルチューブをテーブルの上に置きます。 50kVの電圧と600μAの電流でサンプルをスキャンし、焦点から中心までの距離75.2mmを確保します。注:1ボクセルの寸法は、この設定で28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μmでした。 取得した画像データを、生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォームであるフィジーと一緒にロードします。 胃腸筋を用いて筋肉ボクセル値を決定する。 長方形ツールを使用して胃食道筋を選択します。 ヒストグラムからの平均と標準偏差(SD)を確認します(分析|ヒストグラム)。 筋肉ボクセル密度を、胃内形成筋の平均+ 2SDとして定義します。 筋肉ボクセル密度を下限しきい値レベルに設定します(画像|調整|しきい値||を設定するしきい値レベルを下げる)。注: しきい値が設定された後も、血管領域と骨領域は二項化データに残ります。