Qui, descriviamo un metodo di visualizzazione e quantificazione per i vasi murini degli arti posteriori utilizzando la tomografia computerizzata a micro-raggi X.
I vasi sanguigni sono reti complesse con strutture simili ad alberi e le reti vascolari sono essenziali per mantenere sia la circolazione che la funzione degli organi. Chiarire il meccanismo di formazione dei vasi sanguigni è quindi estremamente utile per chiarire i processi di sviluppo e i meccanismi patologici. I vasi murini degli arti posteriori sono spesso usati come modello per l’angiogenesi fisiologica e patologica. La valutazione viene eseguita principalmente tramite un metodo bidimensionale utilizzando sezioni di tessuto. Tuttavia, i metodi per valutare la morfologia vascolare tridimensionale (3D) sono particolarmente limitati. Questo documento introduce un metodo per visualizzare gli arti posteriori murini utilizzando la tomografia computerizzata (TC). La resina opaca per radiazioni viene iniettata attraverso l’aorta discendente e interi vasi vengono riempiti di colorante. Regolando il tempo di iniezione del colorante, è anche possibile il riempimento arterioso specifico e i campioni possono essere ottenuti con qualsiasi dispositivo TC a micro-raggi X. Questo metodo di contrasto fornisce una tecnica di base per la valutazione 3D dei vasi sanguigni murini negli arti inferiori. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare tutti i vasi sanguigni sotto il diaframma e valutare i vasi sanguigni negli organi addominali.
I vasi sanguigni sono reti complesse con strutture simili ad alberi. L’angiogenesi e la nuova formazione vascolare svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell’omeostasi d’organo1. L’angiogenesi è regolata per il trattamento delle malattie ischemiche e maligne2. È quindi essenziale comprendere i meccanismi alla base dell’angiogenesi. I vasi murini degli arti posteriori sono spesso usati come modello utile per la ricerca vascolare3; la legatura ipsilaterale dell’arteria iliaca o femorale è un noto modello di ischemia degli arti posteriori utilizzato per valutare l’angiogenesi e il rimodellamento vascolare nell’angiogenesi fisiologica e patologica4. Tuttavia, la valutazione dell’angiogenesi viene eseguita principalmente mediante colorazione di sezione e i metodi per valutare la morfologia vascolare 3D sono particolarmente limitati.
Rispetto alla colorazione della sezione, la TC consente la visualizzazione 3D. Recentemente, Weyers et al. hanno riportato un sofisticato protocollo adatto per l’imaging TC, che consente la visualizzazione del sistema circolatorio coronarico adulto murino5. Abbiamo modificato il loro metodo per creare un metodo di preparazione del campione adatto per l’imaging TC dei vasi sanguigni degli arti inferiori6. Qui, una resina opaca per le radiazioni viene iniettata attraverso l’aorta discendente e i vasi negli arti inferiori sono pieni di colorante. Regolando il tempo di iniezione del colorante, è anche possibile il riempimento arterioso specifico e i campioni possono essere ottenuti con qualsiasi dispositivo di tomografia computerizzata a micro-raggi X. Questo metodo di contrasto fornisce una tecnica di base per la valutazione 3D dei vasi sanguigni murini sotto il diaframma e negli organi addominali e negli arti inferiori.
Questo rapporto introduce un metodo sofisticato per visualizzare i vasi sanguigni nella parte inferiore del corpo. Ci sono diversi passaggi critici in questo processo: il primo è la preperfusione prima dell’iniezione del mezzo di contrasto. Se non viene rimosso abbastanza sangue, il contrasto non riempirà il sistema. Inoltre, l’inclusione di bolle d’aria disturba il riempimento del contrasto; pertanto, l’aria nel circuito deve essere completamente rimossa. Inoltre, poiché il mezzo di contrasto non si solidifica immediatamente dopo l’iniezione, il campione non deve essere spostato eccessivamente.
Questo metodo è utile per valutare l’aumento della formazione di vasi sanguigni e della circolazione, come la circolazione collaterale. Al contrario, come limitazione, è difficile valutare i vasi sanguigni ristretti, poiché è difficile distinguere tra stenosi e riduzione artificiale del mezzo di contrasto. Inoltre, è difficile valutare i vasi sanguigni nelle ossa, poiché la separazione del sangue e delle ossa è difficile.
Un metodo alternativo per la visualizzazione 3D è l’immunocolorazione. Utilizzando la tecnica di pulizia dei tessuti, sono disponibili diversi metodi per l’imaging 3D7. L’immunocolorazione è vantaggiosa in quanto consente la colorazione di proteine specifiche utilizzando anticorpi. Un recente rapporto sfida l’imaging di tutto il corpo basato sull’immunocolorazione8; tuttavia, l’imaging basato sulla TC non richiede alcun pretrattamento di pulizia dei tessuti.
Questo metodo consente la visualizzazione di tutti i vasi sotto il diaframma, compresi gli organi addominali. L’angiogenesi negli organi addominali ha un forte impatto sul mantenimento dell’omeostasi e sullo sviluppo di malattie9,10. Poiché questo protocollo è stato ottimizzato per la valutazione dei vasi degli arti inferiori, l’innesco organo-specifico consentirebbe la visualizzazione dell’angiogenesi associata a qualsiasi fattore, come l’infiammazione o i tumori.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro e Saeko Tokunaga per l’eccellente supporto tecnico negli esperimenti sugli animali.
1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
5 mL syringe | |||
5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |