הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית מבוססת טומוגרפיה ממוחשבת של כלי דם הינדיים של מורין
Summary
כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה וכימות לכלי גפיים אחוריות של מורין באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו-רנטגן.
Abstract
כלי הדם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ, ורשתות כלי דם חיוניות לשמירה על זרימת הדם ושמירה על תפקוד האיברים. הבהרת המנגנון של היווצרות כלי הדם היא אפוא שימושית ביותר להבהרת תהליכים התפתחותיים ומנגנונים פתולוגיים. כלי גב-גפיים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל לאנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית. ההערכה מתבצעת בעיקר באמצעות שיטה דו-ממדית באמצעות מקטעי רקמות. עם זאת, שיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם תלת מימדית (3D) מוגבלות במיוחד. מאמר זה מציג שיטה להדמיה של איברים אחוריים מוריניים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT). שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי דם שלמים מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר CT מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים בגפיים התחתונות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לדמיין את כל כלי הדם מתחת לסרעפת ולהעריך את כלי הדם באיברי הבטן.
Introduction
כלי דם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ. אנגיוגנזה ויצירת כלי דם חדשים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס איברים1. אנגיוגנזה מווסתת לטיפול במחלות איסכמיות וממאירות2. לכן חיוני להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה. כלי דם אחוריים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל שימושי למחקר כלי דם3; קשירה ipsilateral של איליאק או עורק הירך הוא מודל איסכמיה אחורית ידועה המשמש להערכת אנגיוגנזה ושיפוץ כלי דם אנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית4. עם זאת, ההערכה של אנגיוגנזה מבוצעת בעיקר על ידי כתמי סעיף, ושיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם 3D מוגבלות במיוחד.
בהשוואה לכתמי מקטעים, CT מאפשר הדמיה תלת-ממדית. לאחרונה, Weyers ואח ‘ דיווח פרוטוקול מתוחכם מתאים הדמיה CT, המאפשר הדמיה של מערכת הדם הכלילית למבוגרים murine5. שינינו את השיטה שלהם כדי ליצור שיטת הכנת מדגם המתאימה להדמיית CT של כלי הדם בגפיים התחתונות6. כאן, שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי הדם בגפיים התחתונות מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר טומוגרפיה ממוחשב מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים מתחת לסרעפת ובאברי הבטן ובגפיים התחתונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו”ח זה מציג שיטה מתוחכמת לדמיין כלי דם בפלג הגוף התחתון. ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה: הראשון הוא preperfusion לפני הזרקת מדיום ניגודיות. אם לא יוסר מספיק דם, הניגודיות לא תמלא את המערכת. בנוסף, הכללת בועות אוויר מפריעה למילוי הניגודיות; לפיכך, יש להסיר לחלוטין את האוויר במעגל. יתר על כן, מכיוון שמדיום הניגודיות אינו מתמצק מיד לאחר ההזרקה, אין להזיז את המדגם יתר על המידה.
שיטה זו שימושית כדי להעריך את היווצרות מוגברת של כלי דם ומחזור הדם, כגון זרימת הדם בטחונות. לעומת זאת, כמגבלה, קשה להעריך כלי דם מצומצמים, שכן קשה להבחין בין היצרות לבין ירידה מלאכותית במדיום ניגודיות. בנוסף, זה מאתגר להעריך את כלי הדם בעצמות, כמו ההפרדה של דם ועצמות קשה.
שיטה חלופית להדמיה תלת-ממדית היא חיסון. באמצעות טכניקת ניקוי הרקמות, מספר שיטות זמינות עבור הדמיה 3D7. חיסון הוא יתרון כפי שהוא מאפשר כתמים של חלבונים ספציפיים באמצעות נוגדנים. דו”ח שנערך לאחרונה מאתגר הדמיה לכל הגוף בהתבסס על חיסון8; עם זאת, הדמיה מבוססת CT אינה דורשת טיפול מקדים לניקוי רקמות.
שיטה זו מאפשרת הדמיה של כל כלי הדם מתחת לסרעפת, כולל איברי הבטן. אנגיוגנזה באיברי הבטן יש השפעה חזקה על שמירה על הומאוסטזיס ופיתוח מחלות9,10. כמו פרוטוקול זה היה מותאם להערכה של כלי הגפיים התחתונות, פרימינג ספציפי לאיברים יאפשר הדמיה של אנגיוגנזה הקשורים לכל גורם, כגון דלקת או גידולים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליסויו קימורה, מגומי נגהירו וסאקו טוקונאגה על התמיכה הטכנית המצוינת בניסויים בבעלי חיים.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
