إعداد عينة للتصور ثلاثي الأبعاد القائم على التصوير المقطعي المحوسب لأوعية الأطراف الخلفية الفئرانية
Summary
هنا ، نصف طريقة التصور والقياس الكمي لأوعية الأطراف الخلفية الفئرانية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية الدقيقة.
Abstract
الأوعية الدموية هي شبكات معقدة ذات هياكل تشبه الأشجار ، وشبكات الأوعية الدموية ضرورية للحفاظ على كل من الدورة الدموية والحفاظ على وظيفة الأعضاء. وبالتالي فإن توضيح آلية تكوين الأوعية الدموية مفيد للغاية لتوضيح العمليات التنموية والآليات المرضية. غالبا ما تستخدم أوعية الأطراف الخلفية الفئرانية كنموذج لتكوين الأوعية الفسيولوجية والمرضية. يتم إجراء التقييم بشكل أساسي عن طريق طريقة ثنائية الأبعاد باستخدام أقسام الأنسجة. ومع ذلك ، فإن طرق تقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D) محدودة بشكل خاص. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور الأطراف الخلفية الفئرانية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب (CT). يتم حقن الراتنج غير الشفاف إشعاعيا من خلال الشريان الأورطي الهابط ، وتمتلئ الأوعية بأكملها بالصبغة. من خلال ضبط وقت حقن الصبغة ، يمكن أيضا ملء خاص بالشرايين ، ويمكن الحصول على عينات باستخدام أي جهاز تصوير مقطعي بالأشعة السينية الدقيقة. توفر طريقة التباين هذه تقنية أساسية لتقييم 3D للأوعية الدموية الفئرانية في الأطراف السفلية. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور جميع الأوعية الدموية أسفل الحجاب الحاجز وتقييم الأوعية الدموية في أعضاء البطن.
Introduction
الأوعية الدموية هي شبكات معقدة ذات هياكل تشبه الأشجار. يلعب تكوين الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية الجديدة أدوارا أساسية في الحفاظ على توازن الأعضاء1. يتم تنظيم تولد الأوعية الدموية لعلاج الأمراض الإقفارية والخبيثة2. لذلك من الضروري فهم الآليات الكامنة وراء تولد الأوعية. غالبا ما تستخدم أوعية الأطراف الخلفية الفئرانية كنموذج مفيد لأبحاث الأوعية الدموية3. الربط الجانبي للشريان الحرقفي أو الفخذي هو نموذج معروف لنقص تروية الأطراف الخلفية يستخدم لتقييم تكوين الأوعية الدموية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في تكوين الأوعية الفسيولوجية والمرضية4. ومع ذلك ، يتم إجراء تقييم تولد الأوعية الدموية بشكل رئيسي عن طريق تلطيخ القسم ، وطرق تقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية 3D محدودة بشكل خاص.
بالمقارنة مع تلطيخ القسم ، يتيح التصوير المقطعي المحوسب تصور 3D. في الآونة الأخيرة ، أبلغ Weyers et al. عن بروتوكول متطور مناسب للتصوير المقطعي المحوسب ، مما يتيح تصور نظام الدورة الدموية التاجية للبالغين الفئران5. قمنا بتعديل طريقتهم لإنشاء طريقة لإعداد العينات مناسبة للتصوير المقطعي المحوسب للأوعية الدموية في الأطراف السفلية6. هنا ، يتم حقن راتنج معتم إشعاعيا من خلال الشريان الأورطي الهابط ، وتمتلئ الأوعية في الأطراف السفلية بالصبغة. من خلال ضبط وقت حقن الصبغة ، يمكن أيضا ملء خاص بالشرايين ، ويمكن الحصول على عينات باستخدام أي جهاز تصوير مقطعي محوسب بالأشعة السينية الدقيقة. توفر طريقة التباين هذه تقنية أساسية لتقييم 3D للأوعية الدموية الفئرانية أسفل الحجاب الحاجز وفي أعضاء البطن والأطراف السفلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا التقرير طريقة متطورة لتصور الأوعية الدموية في الجزء السفلي من الجسم. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه العملية: الأولى هي الانصهار المسبق قبل حقن وسط التباين. إذا لم تتم إزالة ما يكفي من الدم ، فلن يملأ التباين النظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إدراج فقاعات الهواء يزعج ملء التباين ؛ وبالتالي ، يجب إزالة الهواء الموجود في الدائرة بالكامل. علاوة على ذلك ، نظرا لأن وسط التباين لا يتصلب مباشرة بعد الحقن ، فلا ينبغي نقل العينة بشكل مفرط.
هذه الطريقة مفيدة لتقييم زيادة تكوين الأوعية الدموية والدورة الدموية ، مثل الدورة الدموية الجانبية. على العكس من ذلك ، كقيد ، من الصعب تقييم الأوعية الدموية الضيقة ، حيث أن التمييز بين التضيق والتخفيض الاصطناعي في وسط التباين أمر صعب. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب تقييم الأوعية الدموية في العظام ، حيث أن فصل الدم والعظام أمر صعب.
طريقة بديلة للتصور 3D هي التلطيخ المناعي. باستخدام تقنية إزالة الأنسجة ، تتوفر عدة طرق للتصوير ثلاثي الأبعاد7. التلطيخ المناعي مفيد لأنه يسمح بتلطيخ بروتينات معينة باستخدام الأجسام المضادة. ويتحدى تقرير صدر مؤخرا التصوير لكامل الجسم استنادا إلى التلطيخ المناعي8؛ ومع ذلك ، لا يتطلب التصوير القائم على التصوير المقطعي المحوسب أي معالجة مسبقة لإزالة الأنسجة.
تتيح هذه الطريقة تصور جميع الأوعية الموجودة أسفل الحجاب الحاجز ، بما في ذلك أعضاء البطن. تولد الأوعية الدموية في أعضاء البطن له تأثير قوي على الحفاظ على التوازن وتطوير الأمراض9,10. نظرا لأن هذا البروتوكول قد تم تحسينه لتقييم أوعية الأطراف السفلية ، فإن التحضير الخاص بالأعضاء سيمكن من تصور تكوين الأوعية المرتبط بأي عامل ، مثل الالتهاب أو الأورام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ياسويو كيمورا وميغومي ناغاهيرو وسايكو توكوناغا على الدعم الفني الممتاز في التجارب على الحيوانات.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
