Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans
Summary
Следующий протокол описывает разработку и оптимизацию высокопроизводительного рабочего процесса для культивирования червей, флуоресцентной визуализации и автоматизированной обработки изображений для количественной оценки агрегатов полиглутамина в качестве оценки изменений в протеостазе.
Abstract
Рост распространенности нейродегенеративных белковых конформационных заболеваний (ПХД) на протяжении многих лет способствовал большому интересу к этой теме. Это повышенное внимание потребовало диверсификации и улучшения животных моделей, способных воспроизводить фенотипы заболеваний, наблюдаемые у людей с ПХД. Хотя мышиные модели оказались бесценными, они дороги и связаны с трудоемкими методами с низкой пропускной способностью. Использование модели нематод Caenorhabditis elegans для изучения ПХД было оправдано относительной простотой обслуживания, низкой стоимостью и быстрым временем генерации, что позволяет использовать приложения с высокой пропускной способностью. Кроме того, высокая сохранность между геномами C. elegans и человека делает эту модель бесценным инструментом открытия. Нематоды, которые экспрессируют флуоресцентно помеченные тканеспецифические полиглутаминные (polyQ) тракты, демонстрируют возрастную и полиQ-зависимую агрегацию, характеризующуюся флуоресцентными очагами. Такие репортеры часто используются в качестве прокси для мониторинга изменений протеостаза в тканях. Ручная агрегированная количественная оценка занимает много времени, ограничивая экспериментальную пропускную способность. Кроме того, ручная количественная оценка фокусов может привести к смещению, поскольку агрегированная идентификация может быть очень субъективной. При этом протокол, состоящий из культивирования червей, сбора изображений и обработки данных, был стандартизирован для поддержки высокопроизводительной агрегированной количественной оценки с использованием C. elegans , которые экспрессируют специфический для кишечника polyQ. Благодаря реализации конвейера обработки изображений на основе C. elegans с использованием CellProfiler, программного обеспечения для анализа изображений, этот метод был оптимизирован для разделения и идентификации отдельных червей и перечисления их соответствующих агрегатов. Хотя концепция автоматизации не совсем уникальна, необходимость стандартизации таких процедур для воспроизводимости, устранения смещения от ручного подсчета и увеличения пропускной способности высока. Ожидается, что эти методы могут значительно упростить процесс скрининга больших бактериальных, геномных или лекарственных библиотек с использованием модели C. elegans .
Introduction
Возрастные нейродегенеративные белковые конформационные заболевания (PCD), такие как болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона, или боковой амиотрофический склероз, характеризуются неправильным сворачиванием белка, что приводит к агрегации, гибели клеток и дегенерации тканей1. В то время как неправильное сворачивание белка признано виновником, этиология этих заболеваний не ясна. Таким образом, разработка эффективных методов лечения сдерживается отсутствием знаний о факторах и условиях, которые способствуют возникновению и прогрессированию заболевания. Недавние исследования показывают, что изменения в микробиоме влияют на начало, прогрессирование и тяжесть ПХД 2,3,4. Однако сложность человеческого или даже мышиного микробиома затрудняет проведение исследований, которые бы выявили точное влияние микробов на их хозяина. Поэтому более простые организмы, такие как Caenorhabditis elegans, часто используются в качестве инструмента открытия 5,6,7,8. Недавние исследования использовали C. elegans для изучения влияния бактерий на протеостаз хозяина и патогенез заболевания 9,10. Бактериальная колонизация, гормезис и геномные изменения относятся к числу примерных состояний, влияющих на агрегацию полиглутамина (polyQ) трактов 9,11,12. Кроме того, эти неправильно свернутые белковые кластеры демонстрируют накопление polyQ в зависимости от длины и возраста внутри хозяина и связаны с нарушением моторики 9,13. Относительно простой подход к количественной оценке флуоресцентно меченой пункты может генерировать важные данные об условиях, факторах или лекарствах, которые влияют на сворачивание и агрегацию белка.
Хотя количественная оценка флуоресцентной пункты оказалась надежной и относительно простой процедурой, остается задача разработать протокол, который облегчил бы крупномасштабный скрининг соединений, бактерий или состояний, влияющих на агрегацию белка. Концепция автоматизированной обработки изображений C. elegans и количественной оценки puncta не совсем нова, так как ряд практических вспомогательных инструментов был разработан14,15. Тем не менее, интеграция культивирования, получения изображений и конвейера обработки имеет важное значение для устранения изменчивости результатов и обеспечения более высокой пропускной способности экранов.
Таким образом, целью этой рукописи является стандартизация процедуры, используемой для количественной оценки агрегации polyQ в C. elegans в качестве прокси для обнаружения изменений в протеостазе. Эта задача была выполнена за счет использования CellProfiler, программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом16 , способного к автоматизированной идентификации червей и агрегатов, и интегрированного в более крупный протокол для культивирования червей, получения изображений и обработки данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол описывает процедуры культивирования, визуализации и обработки изображений C. elegans , которые включают CellProfiler, программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом. Репрезентативные результаты демонстрируют воспроизводимость, уменьшение предвзятости и масштабируемость. Эта стандартизированная процедура улучшит стратегии скрининга, используемые с большими бактериальными, геномными или лекарственными библиотеками. В то время как существуют другие автоматизированные методы обнаружения объектов C. elegans , описанный метод предлагает стандартизированный конвейер с более высокой пропускной способностью, который объединяет культивирование, получение изображений и анализ.
Несколько вариантов культивирования червей должны были быть протестированы для оптимизации протокола, описанного в настоящем документе. Первоначально черви переносились на образцы бактерий сразу после возрастной синхронизации (стадия L1). Однако такой подход привел к популяции червей с переменными размерами, даже среди червей в пределах одной скважины. C. elegans известны избеганием патогенов19, что могло способствовать наблюдаемой изменчивости в размерах и в конечном итоге повлиять на обнаружение червей вниз по течению, в частности. Чтобы исключить такую изменчивость, вся площадь NGM в каждой скважине была покрыта тестовыми бактериями. Кроме того, червей кормили E. coli OP50 и позволяли полностью развиться в молодых людей в течение 48 ч при 25 °C. Позволив червям достичь совершеннолетия на E. coli OP50 до переноса их на тестируемые бактерии, привело к более стабильному размеру тела. Кроме того, перенаселенность и быстрое истощение продуктов питания потомством были устранены путем добавления агара NGM с FUDR. Внедрение FUDR удалило потомство и улучшило автоматическую идентификацию червей, которая была скрыта смешиванием потомства с родительской популяцией. Тем не менее, важно быть осторожным и использовать соответствующие средства контроля при использовании FUDR, так как соединение, как известно, влияет на протеостаз C. elegans и продолжительность жизни20,21. В условиях, описанных в этом протоколе, FUDR не влиял на агрегацию полиQ кишечника (дополнительный рисунок 5); поэтому его использование было подходящим и выгодным для описанного способа.
Замораживание образцов перед визуализацией оказалось критическим шагом в успешном использовании трубопровода. Совокупные подсчеты до замораживания были значительно выше, чем ручные подсчеты (диаграмма 3В). Сохранение червей при -20 °C в течение 18-48 ч до получения изображения снижало фоновую флуоресценцию и в конечном итоге улучшало обнаружение агрегатов (рисунок 3A). Влияние замораживания на обнаружение агрегатов было исследовано только для polyQ и не должно быть обобщено на другие модели без дальнейшего изучения таких эффектов.
Несмотря на то, что все условия сохраняются одинаковыми, было отмечено, что среднее число агрегатов на червя может варьироваться между различными прогонами, в то время как соотношение между количеством агрегатов у животных, колонизированных OP50, и MPAO1 остается неизменным (рисунок 6, дополнительный рисунок 2, дополнительный рисунок 5). Поэтому важно всегда включать E. coli OP50 control или любые дополнительные подходящие эталонные элементы управления в каждый запуск. На такую изменчивость совокупных подсчетов между экспериментами могут влиять условия окружающей среды (температура, влажность)22,23 или генетический фон8. Фактически было замечено, что после длительной культивирования флуоресценция кишечника резко снижалась или полностью терялась, что требовало размораживания нового штамма из замороженного запаса. Наблюдаемое снижение флуоресценции может быть результатом генетических изменений, которые подавляют токсичные трансгены, такие как экспрессирующие polyQ. Тем не менее, исключительная воспроизводимость результатов, наблюдаемых между различными экспериментаторами (дополнительный рисунок 2), между биологическими репликами (рисунок 5) и в пределах одной и той же выборки (дополнительный рисунок 3), подчеркивает силу этого подхода.
Многочисленные отчеты использовали кишечный polyQ для изучения протеостаза 9,11,12,13,24,25. Однако прямое сравнение результатов не может быть сделано из-за изменчивости экспериментальных подходов и методов считывания. Тем не менее, некоторые результаты из ранее опубликованных данных повторяются автоматизированной количественной оценкой, описанной в настоящем описании, включая бактериальную индукцию агрегации 9,13 и сопоставимое число агрегатов11. В совокупности описанный конвейер предлагает ценный инструмент для изучения протеостаза.
Способ, описанный в настоящем описании, имеет некоторые неотъемлемые проблемы. Например, требуется достаточно времени для освоения всех компонентов этого протокола, что особенно верно для раздела 8 протокола, который требует знакомства с анализом, чтобы определить, подходят ли полученные изображения для анализа конвейера. Возможны отклонения от настроек получения изображения, используемых в этом протоколе; однако, скорее всего, потребуется изменить настройки и набор для обучения червей. Этот конвейер может различать агрегаты различных размеров и те, которые касаются, что ограничивает «смешивание» агрегатов и в конечном итоге повышает чувствительность обнаружения. Однако при попытке идентифицировать крупные агрегаты, которые превышают допустимый диапазон размеров, могут возникнуть проблемы, поскольку расширение верхнего порогового значения размера может привести к ошибкам, вызванным плохой идентификацией, такой как неспособность дифференцировать агрегаты, которые касаются. Баланс между точностью, размером и интенсивностью должен быть найден до анализа изображения. Эффективность агрегированной идентификации может быть дополнительно улучшена путем включения машинного обучения для создания нейронной сети, способной улучшить обнаружение агрегатов. Такие усовершенствования в настоящее время изучаются и будут в значительной степени способствовать решению текущих проблем, таких как обнаружение агрегатов, которые лежат на разных фокальных плоскостях или имеют аномальные формы.
Одним из заметных недостатков описанного метода является изменчивость автоматизированных агрегатных подсчетов, поскольку они не всегда повторяются ручными подсчетами у червей, получавших различные бактериальные штаммы. Например, основываясь на автоматизированных подсчетах, черви, питавшиеся мутантом P. aeruginosa 53 (M53), имели значительно меньше агрегатов по сравнению со штаммом дикого типа (MPAO1) (рисунок 7); однако подтверждение хита не показало существенной разницы (дополнительный рисунок 4). В целом, высокопроизводительные скрининги лекарств имеют высокий уровень обнаружения ложноположительных попаданий, и описанный метод не является исключением26. Таким образом, это критическая часть протокола для подтверждения всех потенциальных попаданий.
Хотя этот протокол был оптимизирован для соответствия стратегии скрининга для идентификации бактерий, которые влияют на протеостаз хозяина, каждый шаг может быть дополнительно модифицирован для проверки эффекта геномных библиотек РНКI, малых молекул или других условий. На каждом этапе могут быть внесены дополнительные изменения в соответствии с требованиями конкретной стратегии скрининга. Кроме того, этот метод обеспечивает уровень гибкости, который позволяет оптимизировать каждый шаг в соответствии с конкретной моделью. Например, этот подход может быть распространен на агрегацию polyQ в других тканях или извлечение других признаков, обнаруженных на изображениях, таких как мониторинг экспрессии генов с использованием индуцируемых флуоресцентных репортеров (например, генов теплового шока), оценка субклеточной локализации белков (например, ядерная локализация DAF-16), изучение агрегации в других моделях заболеваний (Aβ1-42, α-синуклеин, TDP-43 и т. Д.) например, размер червя.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (1RO3AG069056-01) и Обществом инфекционных заболеваний Америки, финансирующим dMC. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим членов Czyz Lab за корректуру рукописи. Мультяшные фигурки были сгенерированы с использованием платной лицензии BioRender.
Materials
| 1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
| 10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
| 15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
| Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
| BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
| Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
| C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
| C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
| CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
| Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
| CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
| 16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
| Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
| Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
| GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
| Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
| Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
| K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
| KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
| LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
| Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
| Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
| Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
| Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
| MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
| Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
| NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
| NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
| Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
| Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
| Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
| Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
| Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
| Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
| TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
| Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
| Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |
References
- Soto, C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).
- Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk. Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).
- Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. Our gut microbiome: The evolving inner self. Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).
- Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Walker, A. C., et al. Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate. PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).
- Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).
- Hakim, A., et al. WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms. BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).
- Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).
- Schulenburg, H., Ewbank, J. J. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).
- Shinn-Thomas, J. H. Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth. BMC Research Notes. 12 (1), (2019).
- Alexander-Floyd, J., et al. Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans. BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. False positives in the early stages of drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).
