Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化

すべての手順は、フロリダ大学の機関バイオセーフティ委員会によってレビューおよび承認された安全ガイドラインに従っていました。生物学的安全性レベル2の細菌への曝露のリスクを軽減するために、適切なバイオセーフティ対策が講じられた。 注:すべての実験において、 C. elegans は、 エシェリヒ ア・コリOP50を播種した線虫増殖培地(NGM)プレート上で増殖させ、維持しなければならない。 1. 10cmNGMプレートの作製 2Lフラスコに3gのNaCl、2.5gのトリプチカーゼ – ペプトン、および17gの寒天を混ぜ合わせ、1Lに二重蒸留水(ddH2O)で満たします。オートクレーブ処理の前に磁気攪拌子を加える。 混合物を121°Cおよび21psiの圧力で45分間オートクレーブする。混合物を水浴中で50°Cまで冷まします。 無菌技術を使用して、以下の滅菌溶液を加える:1mLの1M CaCl2·2H2O, 1 mL の 1 M MgSO4·7H2O、100%エタノールに溶解した5mg/mLコレステロール1mL(室温まで加温)、および25mLの1MKH2PO4(pH=6.0)。 磁気攪拌盤を用いて混合する。混合は、700RPMで1分間行えばよい。 混合物が10cmプレート全体を満たすまで注ぐ。あるいは、目盛り付き血清学的ピペットを使用して、プレートあたり約20mLの混合物を加える。 細菌を播種する前にプレートを室温で24時間乾燥させるか、乾燥後にプレーンプレートを4°Cで保存します。メモ: すべてのメディアコンポーネントは、無菌技術を使用して処理されます。ステップ1.3-1.4は、層流フードで実行する必要があります。 2. 24ウェルプレートにおけるFUDRによるNGM寒天の調製 手順 1.1-1.3 に従います。 NGMに5-フルオロ-2′-デオキシウリジン(FUDR)を補充し、混合して最終濃度100μg/mLを達成します。注:FUDRはDNA複製を阻害し、その結果、生殖細胞系列および胚発生を標的とすることによって C.エレガンスの 再生をブロックし、最終的に寿命に影響を及ぼす。したがって、FUDR含有プレートに移る前に、ワームが若年成人に完全に発達できるようにすることが重要です。警告: FUDR は有毒であるため、製造元の安全データシートに従って取り扱う必要があります。 ピペットガンを用いて、NGM-FUDRを1mLずつ各ウェルに分注する。注:このプロセスは、自動プレート注ぎシステムを使用することで促進できます。 プレートを室温で24時間乾燥させてから、細菌を播種するか、プレーンプレートを4°Cで保管します。 3.プレートの播種:OP50および追加の試験細菌 一晩 の大腸菌 OP50培養物を調製するために、凍結ストックからの細菌アリコート200μLを、250mLの新鮮で滅菌されたルリアブロス(LB)を含む500mL三角フラスコに加える。メモ: メディアの容量は、シードする必要があるプレートの数によって異なります。他の細菌培養物を調製するには、滅菌マイクロピペットチップを用いて、凍結ストックからの細菌を5mLの増殖培地を含む16mL培養チューブに接種する。 37°Cのインキュベーター内で一晩インキュベートし、220RPM(毎分回転)で振とうする。注:少なくとも2倍の作動量の媒体を含む滅菌フラスコを使用し、オートクレーブ処理されたアルミニウム箔でシールしてください。無菌技術を用いて接種工程および細菌分注を行う。 一晩 大腸菌 OP50培養物を各10cmNGMプレートの中央に1〜2mL分注する。この培養物をNGMプレートの周囲に広げる必要はない。 使用/保管前にプレートを室温で乾燥させてください。注:蓋付きの播種プレートは、乾燥を容易にするために気流のあるフードに入れることができます。 4.プレートの培養と播種:24ウェルプレート 所望の細菌株の一晩培養物を調製し、ステップ3.1〜3.2に見られる培養指示に従う。 各細菌培養物200 μLをNGM寒天を含む24ウェルプレートの各ウェルに移す。200μLのバクテリア容量が寒天領域全体をカバーし、ワームがバクテリアの芝生を避けないように食物の量を最大化します。 乾燥を容易にするために、生物学的安全キャビネット(BSC)でプレートをひび割れたままにしておきます。プレートを定期的にチェックして過度の脱水を防ぎ、プレートの向きを変更して気流と乾燥を促進します。プレートは5時間以内に乾燥する必要があります。注:生物学的安全レベル2の細菌を用いた作業は、認定BSCで実施し、機関バイオセーフティ委員会によって承認されなければなりません。 5. 年齢同期 メモ:すべての手順は、適切な無菌技術(すなわち、炎の近くまたはBSC内で作業)を使用して実行する必要があります。 フィルター滅菌M9溶液(5.8gのNa2HPO4·7H2O、3.0gのKH2PO4、5gのNaCl、0.25gのMgSO4・7H2O、1LのddH2O)。 滅菌ガラスまたはプラスチック血清学的ピペットを使用してプレート上にM9溶液を数回ピペットし、細菌芝生からワームを持ち上げます。 ワーム懸濁液を集め、溶液を15mLポリスチレン円錐管に移す。 遠心分離機を270 x g、室温(RT、〜23°C)、2分間保持する。 真空トラップフラスコを使用して吸引し、上清を捨てて、ワームペレットを邪魔しないままにします。 ペレットを5〜10mLのM9に再懸濁してワームを洗浄し、ステップ5.2〜5.3を2回繰り返す。 5 mLの20%漂白溶液(8.25 mLのddH2O、3.75 mLの1M NaOH、3.0 mLの非殺菌性漂白剤)をチューブに加え、連続的に反転させてワームを溶解する。ワームは、ほぼ完全に溶解したら遠心分離する準備ができています。注:漂白時間と漂白溶液の量は、サンプルのサイズに依存します。オーバーブリーチングとアンダーブリーチングは一般的なエラーです。そのため、このプロセスでは一般に、サンプルが遠心分離の準備が整う時期を判断するための最適化が必要です。 423 x g で2分間遠心分離し、上清を捨てる。 10mLの滅菌M9を加えて、卵ペレットを再懸濁する。 チューブを423 x g で2分間遠心分離して卵をペレット化します。アスピレーターフラスコで上清を除去します。 手順 5.6 ~ 5.6.1 を繰り返します。 卵ペレットを5mLの滅菌M9に再懸濁し、所望の温度で一晩ヌーテーターの上に置く。注:年齢同期L1幼虫は、翌日プレートに移す準備ができています。 6. ワームの準備ポストエージング同期 年齢同期ワームを270 x g でRT(~23°C)で3分間遠心分離します。 フローフードやブンゼンバーナーの隣などの清潔な環境で上清を吸引します。約200μLの上清を残し、ワームを再懸濁する。 マイクロピペットを用いて、濃縮ワーム懸濁液をOP50を予め播種した10cmNGMプレートに移す。注:各プレートは、食物を使い果たすことなく1,500匹のワームをサポートすることができます。しかしながら、この濃度は、細菌芝生の密度および増殖温度に応じて調整を必要とする場合がある。ワームが飢えるのを防ぐために、複数のプレートを使用することをお勧めします。これらのプレートにFUDRが含まれてはならないことに注意することが重要です。 プレートを乾燥させます。その後、反転させ、25°Cで48時間保存する。注:スクリーンの状態に応じて、ステップ6.1のワームを試験プレート(細菌、薬物、または試験化合物を含む)に直接配置することができます。所望の試験条件が発育に影響する場合、ワームを試験条件に曝露する前に、若年成人(〜48時間)までOP50を含むNGM上で培養すべきである。 48時間のインキュベーションに続いて、滅菌M9溶液でプレートからワームを洗い流し、円錐形のチューブに入れます。注:成虫はチューブの底に沈みます。正確な時間は、10cmプレートから回収されたワームの数によって異なります。これらの条件下では、ワームは10分以内に落ち着きます。 目視検査を実行して、残りの卵または孵化した幼虫が除去されるように沈降時間の長さを決定する。 さらに10mLのM9を加えて、ワーム体からの残留細菌をすすいでください。 ワームを23°Cで270 x g で2〜3分間遠心分離します。 洗浄工程をさらに3回行う。最良の結果を得るには、最終洗浄後に約1〜1.5mLのM9溶液をチューブに入れたままにしておきます。 10 μLのワーム懸濁液をスライドガラスに移し、ワームの数を数えます。 ワーム密度を M9 の 10 μL あたり約 150 ワームに調整します。懸濁液中のワームの濃度は、遠心分離後にM9溶液を除去するか、または添加することによって調整することができる。 いくつかの異なる滴からのカウントを平均することによって、所望の濃度が確立されたことを確認する。少なくとも3滴からカウントを平均することをお勧めします。 無菌技術を用いて、約150匹のワームを含む10μLのワーム懸濁液を試験プレートの各ウェルに移す。 顕微鏡下で井戸を検査し、それぞれに十分な数のワームがあることを確認します。インキュベーションの前に追加のワームを追加することができます。 プレートを約10分間乾燥させます。その後、反転させ、25°Cのインキュベーターに72時間移します。注:最終的なインキュベーション期間は、実験のニーズに合わせて調整できます。72時間のインキュベーション時間は、25°Cの24ウェルプレートで200μLの細菌を摂食させた150匹の動物の増殖をサポートするのに十分である。 7. イメージング用のワームの準備 より効果的な沈降を促進し、サンプルの損失を最小限に抑えるには、洗浄前にワームを固定して水泳を防止します。注:少数のサンプルで作業する場合、これはレバミゾール(100μM)への曝露によって達成することができます。しかし、多数のサンプルを扱う場合、ワームは凍結によって固定化することができる。さらに、凍結の延長(18〜24時間)は、調製中のpolyQ凝集体のさらなる発達を妨げる。 マルチウェルプレートを-20°Cで15〜20分間、またはワームが動かなくなるまで置きます。 冷凍庫からサンプルを取り出し、5分間放置します。 マイクロピペットを用いて、M9を1mL加え、4°Cに冷却し、目的のウェルに、プランジャーを4〜6回押し下げて繰り返し、各ウェルのワームを洗浄した。注:時々、ワームはマイクロピペットチップに固執することがあります。そのため、ワームの混合を防ぐために、各ウェル間で異なるチップを使用する必要があります。 ワーム懸濁液を微量遠心管に移し、ワームが底に沈むようにします。 上清を吸引して捨てる。サンプルを合計3回洗浄する。 最終洗浄中にワームが底に落ち着いたら、500 μLの上清を吸引し、500 μLを残してワームを再懸濁させます。 残りのウォーム懸濁液を新しい平底24ウェルプレートに移し、-20°Cの冷凍庫に48時間置きます。注:凍結ワームはバックグラウンド蛍光を低減し、凝集体のより良い視覚化を可能にします。 8. イメージング プレートを冷凍庫から取り出して解凍し、余分な結露を拭き取り、フタを取り外してからイメージングを行います。メモ:画像キャプチャの詳細は、使用する機器やソフトウェアによって異なります。このセクションのプロトコルはガイドとしてのみ役立つべきであり、変更が期待されます。また、tiff ファイル形式で画像をキャプチャすることも必要です。 画像キャプチャ中に、次の顕微鏡設定を使用します:露光時間、500ミリ秒。0.63倍のカメラアダプタ(25.2倍)で倍率40倍、GFP強度を100%に設定。メモ: さまざまな顕微鏡構成およびシステムによって、結果セクションに記載されているものとは異なる画像が取得される可能性があります。必要な画像のより普遍的な記述を達成するために、画像に関するより客観的な詳細が提供される。凝集体は、CellProfiler によって適切に識別されるためには、直径 1.0 ~ 10.0 ピクセルで蛍光強度が 0.10 ~ 1.0 (任意の単位、スケール 0 ~ 1) である必要があります。これらの凝集画像の蛍光バックグラウンドは、一般に0.10閾値未満である。明視野画像の場合、ワームの強度は 0.7 ~ 1.0 の範囲で、背景の強度は 0.1 ~ 0.2 です。明視野画像のワームの平均長さは、頭から尾までの長さが250ピクセルから350ピクセルの範囲です。 暗い背景に比べてワームが明るく照らされるまで、透過光コントロールを調整します。露出過多を避けます;ワームのサイズが大きくなります。 過度の凝集を防ぐために、井戸内のワームの位置を変更する必要があるかもしれません。凝集したワームをピペットチップを使用して分散させます。 チャンネルをGFPに設定して、両方の画像の焦点面を確立します。メモ: 焦点面は GFP チャネルで決定することが不可欠です。明視野画像をキャプチャ中にフォーカスを変更すると、画像解析中に凝集体やワームの位置ずれが生じます。 明視野画像をキャプチャし、プレートを乱すことなく対応する蛍光画像をすぐに撮影します。 パイプラインを介してテストイメージを実行し、手順8.2の後の「NOTE」に従って、イメージ内のオブジェクトの強度とサイズの値を決定します。注: CellProfiler は、解析前にオブジェクトの強度と長さに関するすべての必要な情報を提供できます。 画像を評価するには、まず CellProfiler17 をダウンロードします。ソフトウェアを開き、目的の画像を [画像] ボックスにドラッグ アンド ドロップします。 ファイルリスト内の画像をクリックして開きます。 画面の左上隅にはいくつかのアイコンがあります。オブジェクトのサイズを測定したり、特定の領域を拡大したりするために使用します。拡大鏡ガラスを選択して、関心領域を強調表示します。 矢印アイコンを選択して、ワームとアグリゲートの両方の長さを測定します。 目的のオブジェクトにカーソルを合わせると、画面の下部に表示される強度値が表示されます。注: すべての画像はグレースケールで撮影されるため、赤、青、緑のピクセル値はすべて同じになります。 9. 画像解析 CellProfiler 画像解析パイプラインを利用するには、画像ペアに適切な名前を付けます。次の形式を使用します: P1_A01_S1_C1、P1 は特定のプレートとそのそれぞれの数値指定を参照します。”A” は行を指し、”01″ は列を参照します。「S」は、単一のウェルに対する特定の画像ペアを指す。「C」はチャンネルを指し、「1」は明視野画像、「2」は蛍光画像を示します。 CellProfiler(バージョン4.1.3以上)を公式ウェブサイトからダウンロード17. パイプラインをダウンロードします (補足ファイル 1)。パイプライン (パイプライン) を CellProfiler にアップロードするには、[ファイル] > [ファイルからパイプラインをインポート] >選択します。メモ: モジュール 2 および 3 は、不要とみなされたため無効になっています。画像解析がワームの満足のいく分離と識別をもたらさない場合、それらの機能は回復することができます。ただし、パイプラインの変更が必要です。 これらのモジュールを組み込むには、各モジュールの左側にあるボックスを選択します。”UntangleWorms” モジュールの入力バイナリ イメージの名前を、”convertobjectstoimage” モジュールの出力イメージに変更します。 モジュール 2 に関連する初期使用中にエラー メッセージが表示されることがあります。この問題が発生した場合は、分析を続行します。 ワームの識別に使用するトレーニングセットを「UntangleWorms」モジュールにアップロードします。このトレーニング セットは、 補足ファイル 2 にあります。 UntangleWorms モジュールを選択して、その設定を開きます。 トレーニングセットファイル名を特定し、ファイルのアップロードアイコンを選択します。 補足ファイル 2 (トレーニング セット) をアップロードします。 左上隅にある [画像] モジュールを選択して、画像をアップロードします。手順 9.1 の説明に従って、適切な名前の画像をドラッグ アンド ドロップします。 画像を分析する前に、結果の保存に使用する出力フォルダーを選択します。 プログラムの左下隅近くにある [出力設定] ボタンをクリックします。 「デフォルト出力」の右側にあるフォルダアイコンを選択して、目的の出力場所を選択します。 「イメージの分析」アイコンを選択して、 イメージ分析 を開始します。 解析の完了に時間がかかりすぎて、1 つの画像の処理が行き詰まっている場合は、画像取得の問題が原因である可能性があります。このような場合は、実行を中止し、出力フォルダーを並べ替えて、見つからないイメージ名を書き留めて、未処理のイメージの識別に進みます。注: パイプラインで処理できない大きなアーティファクトや強烈な照明のアーティファクトを除去するために、イメージに追加の処理が必要になる場合があります。場合によっては、そのような画像を解析から除外する必要があります。 完全な分析の後、ソフトウェアは結果を個々のワーム(列N)とそれぞれの集計数(列K)を含むExcelスプレッドシートに整理します。注: 実行に成功すると、各ウェルの識別されたワームあたりの集計数を含む Excel スプレッドシートが生成されます。これらのデータは、実験者によって決定された方法で操作することができる。 補足ファイル 3 (Windows) または補足ファイル 4 (Mac) からメタデータ オーガナイザー (グラフィカル ユーザー インターフェイス) をダウンロードして、CellProfiler からの出力 CSV ファイルからのデータを便利に整理します。注:このソフトウェアには公式ライセンスがなく、ダウンロード後に自動的に開かれることはありません。 Windows OS 64 ビット版を使用している場合は、手順 9.14 ~ 9.17 に従います。ソフトウェアは、Windows 32ビット版では動作しません。Mac OS を使用している場合は、手順 9.18 ~ 9.20 を実行します。手順 9.21 ~ 9.22 は、両方のオペレーティング システムで同じです。 Windows OSの場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて目的の場所に解凍します。 gui_windowsOS_64xという名前の抽出されたフォルダを見つけて開き、「gui」アプリケーションアイコンをクリックしてアプリケーションを起動します。 実行の許可を要求するプロンプトが開くことがあります。 [詳細情報 ] を選択し、[ とにかく信頼] をクリックします。 メタデータ オーガナイザーは、CellProfiler 出力 CSV ファイルをドラッグ アンド ドロップする準備ができました。ステップ 9.21 に進みます。 Mac OSの場合は、ダウンロードしたファイルを見つけてgui_macOS_64x.zip開きます。この手順では、すべてのファイルが自動的に抽出されます。 「ダウンロード」にある抽出されたフォルダを開きます。 「gui」アプリケーションを右クリックし、「 開く」を選択します。公式ライセンスがないために、開く許可を求めるプロンプトが表示されます。「 開く 」を選択し、ステップ 9.21 に進みます。 [ ここにファイルをアップロード ]をクリックするか、目的のCellProfilerCSVファイルをドラッグアンドドロップします。 [ 整理] ボタンをクリックすると、[ ファイルのダウンロード ] ボタンが付いた新しい画面にユーザーが表示されます。ボタンをクリックして、出力ファイルを保存する場所を選択します。出力ファイルは、ファイル名に「_organized」拡張子が追加された元のファイル名として表示されます。