אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans
Summary
הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.
Abstract
עלייה בשכיחות של מחלות קונפורמציה של חלבונים נוירודגנרטיביים (PCDs) טיפחה עניין רב בנושא זה לאורך השנים. תשומת לב מוגברת זו קראה לגיוון ולשיפור של מודלים של בעלי חיים המסוגלים לשחזר פנוטיפים של מחלות שנצפו בבני אדם עם PCDs. אף על פי שמודלים של מורין הוכיחו את עצמם כבעלי ערך רב, הם יקרים וקשורים לשיטות מייגעות ותפוקה נמוכה. השימוש במודל הנמטודה Caenorhabditis elegans לחקר PCDs הוצדק על ידי קלות התחזוקה היחסית שלו, העלות הנמוכה וזמן הייצור המהיר, המאפשרים יישומים בתפוקה גבוהה. בנוסף, שימור גבוה בין ה-C. elegans לבין הגנומים האנושיים הופך את המודל הזה לכלי גילוי שלא יסולא בפז. נמטודות המבטאות דרכי פוליגלוטאמין (polyQ) ספציפיות לרקמות המתויגות באופן פלואורסצנטי מפגינות צבירה תלוית גיל ופולי-Q המאופיינת במוקדים פלואורסצנטיים. כתבים כאלה משמשים לעתים קרובות כפרוקסים כדי לעקוב אחר שינויים בפרוטאוסטזיס על פני רקמות. כימות צבירה ידני גוזל זמן רב, ומגביל את התפוקה הניסויית. יתר על כן, כימות מוקדים ידני יכול להציג הטיה, שכן זיהוי מצרפי יכול להיות סובייקטיבי מאוד. כאן, פרוטוקול המורכב מחקלאות תולעים, רכישת תמונה ועיבוד נתונים תוקן כדי לתמוך בכימות מצטבר בתפוקה גבוהה באמצעות C. elegans המבטאים polyQ ספציפי למעי. על ידי יישום צינור עיבוד תמונה מבוסס C. elegans באמצעות CellProfiler, תוכנה לניתוח תמונות, שיטה זו הותאמה להפרדה ולזיהוי של תולעים בודדות ולמנות את הצברים שלהן בהתאמה. למרות שהמושג אוטומציה אינו ייחודי לחלוטין, הצורך לתקנן נהלים כאלה לצורך שכפול, ביטול ההטיה מספירה ידנית והגדלת התפוקה הוא גבוה. הצפי הוא ששיטות אלה יכולות לפשט באופן דרסטי את תהליך הסינון של ספריות חיידקים, גנומיות או תרופות גדולות באמצעות מודל C. elegans .
Introduction
מחלות קונפורמציה של חלבונים נוירודגנרטיביים תלויי גיל (PCDs) כגון אלצהיימר, פרקינסון ומחלות הנטינגטון, או טרשת אמיוטרופית צידית, מאופיינות בקיפול שגוי של חלבונים שמוביל לצבירה, למוות תאי ולניוון רקמות1. בעוד קיפול שגוי של חלבונים מוכר כאשם, האטיולוגיה של מחלות אלה אינה ברורה. ככזה, פיתוח טיפולים יעילים הופרע על ידי חוסר ידע לגבי הגורמים והתנאים התורמים להופעת המחלה והתקדמותה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ששינויים במיקרוביום משפיעים על ההתחלה, ההתקדמות והחומרה של PCDs 2,3,4. עם זאת, המורכבות של המיקרוביום האנושי, או אפילו של מורין, מקשה על ביצוע מחקרים שיחשפו את ההשפעה המדויקת של מיקרובים על הפונדקאי שלהם. לכן, אורגניזמים פשוטים יותר, כגון Caenorhabditis elegans, משמשים לעתים קרובות ככלי גילוי 5,6,7,8. מחקרים אחרונים השתמשו ב-C. elegans כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים על פרוטאוסטזיס של המארח ועל פתוגנזה של מחלות 9,10. התיישבות חיידקית, הורמזיס ושינויים גנומיים הם בין התנאים המופתיים המשפיעים על צבירה של דרכי פוליגלוטמין (polyQ) 9,11,12. בנוסף, צבירי חלבונים מקופלים באופן שגוי אלה מציגים הצטברות תלוית אורך וגיל של polyQ בתוך הפונדקאי, והם קשורים לפגיעה בתנועתיות 9,13. הגישה הפשוטה יחסית של כימות פונקטה עם תווית פלואורסצנטית יכולה להפיק נתונים חשובים על תנאים, גורמים או תרופות המשפיעים על קיפול וצבירת חלבונים.
אף על פי שכימות של פונקטה פלואורסצנטית הוכח כהליך אמין ופשוט יחסית, האתגר נותר לפתח פרוטוקול שיאפשר סינון בקנה מידה גדול של תרכובות, חיידקים או מצבים המשפיעים על צבירת חלבונים. הרעיון של עיבוד תמונה אוטומטי של C. elegans וכימות פונקטה אינו חדש לחלוטין, שכן פותחו מספר כלי תמיכה מעשיים14,15. עם זאת, השילוב של תרבות, רכישת תמונה וצינור עיבוד חיוניים לביטול השונות בתוצאות ומאפשרים מסכים בעלי תפוקה גבוהה יותר.
ככזה, כוונתו של כתב יד זה היא לתקנן את הפרוצדורה המשמשת לכימות צבירה של polyQ ב- C. elegans כמייצג לזיהוי שינויים בפרוטאוסטזיס. משימה זו הושגה על ידי שימוש ב-CellProfiler, תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח16 המסוגלת לזהות תולעים וצברים אוטומטיים, והיא משולבת בפרוטוקול גדול יותר ללכידת תולעים, רכישת תמונות ועיבוד נתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מתווה נהלים עבור גידול, הדמיה ועיבוד תמונה של C. elegans המשלבים את CellProfiler, תוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח. התוצאות הייצוגיות מדגימות יכולת שכפול, הפחתת הטיה ומדרגיות. הליך סטנדרטי זה ישפר את אסטרטגיות הסינון המופעלות בספריות חיידקים, גנומיות או תרופות גדולות. בעוד ששיטות אוטומטיות אחרות של C. elegans לזיהוי אובייקטים קיימות, הטכניקה המתוארת מציעה צינור סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה יותר המשלב תרבות, רכישת תמונה וניתוח.
היה צורך לבחון מספר וריאציות של גידול תולעים כדי לייעל את הפרוטוקול המתואר כאן. בתחילה, תולעים הועברו לדגימת חיידקים מיד לאחר סנכרון הגיל (שלב L1). עם זאת, גישה כזו הביאה לאוכלוסייה של תולעים בגדלים משתנים, אפילו בקרב תולעים בתוך אותה באר. C. elegans ידועים בהימנעות מפתוגנים19, מה שיכול היה לתרום לשונות הנצפית בגודל ובסופו של דבר להשפיע על זיהוי תולעי הדמיה במורד הזרם, בפרט. כדי למנוע שונות כזו, כל אזור ה-NGM בכל באר כוסה בחיידקי בדיקה. יתר על כן, תולעים הוזנו E. coli OP50 והותר להן להתפתח באופן מלא למבוגרים צעירים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מתן אפשרות לתולעים להגיע לבגרות על E. coli OP50 לפני העברתן לחיידקי בדיקה הביא לגודל גוף עקבי יותר. בנוסף, צפיפות יתר ודלדול מזון מהיר על ידי צאצאים בוטלו על ידי תוספת NGM אגר עם FUDR. היישום של FUDR הסיר את הצאצאים ושיפר את זיהוי התולעים האוטומטי, שהוסתר על ידי התערבבות צאצאים עם אוכלוסיית ההורים. עם זאת, חשוב להיות זהירים ולהשתמש בבקרות מתאימות בעת שימוש ב- FUDR, שכן ידוע כי התרכובת משפיעה על C. elegans proteostasis ועל תוחלת החיים20,21. בתנאים המתוארים בפרוטוקול זה, FUDR לא השפיע על צבירה של פולי-Q במעיים (איור משלים 5); לכן, השימוש בו היה מתאים ומועיל לשיטה המתוארת.
הקפאת דגימות לפני ההדמיה התבררה כשלב קריטי בהעסקה מוצלחת של הצינור. הספירות המצטברות לפני ההקפאה היו גבוהות משמעותית מהספירה הידנית (איור 3B). שמירה על תולעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 18-48 שעות לפני ההדמיה הפחיתה את הפלואורסצנציה ברקע ובסופו של דבר שיפרה את זיהוי הצבירה (איור 3A). ההשפעות של הקפאה על זיהוי צבירה נחקרו רק עבור polyQ ואין להכליל אותן למודלים אחרים ללא חקירה נוספת של השפעות כאלה.
למרות שכל התנאים נשמרו זהים, נצפה כי המספר הממוצע של אגרגטים לכל תולעת יכול להשתנות בין ריצות שונות, בעוד שהיחס בין מספר האגרגטים בבעלי חיים המיושבים עם OP50 לעומת MPAO1 נשאר עקבי (איור 6, איור משלים 2, איור משלים 5). לכן, חיוני לכלול תמיד פקד E. coli OP50, או כל פקדי ייחוס מתאימים נוספים, בכל ריצה. שונות כזו בספירה המצטברת בין הניסויים עשויה להיות מושפעת מתנאי הסביבה (טמפרטורה, לחות)22,23 או מרקע גנטי8. למעשה, נצפה כי לאחר תרבית ממושכת, פלואורסצנציה במעיים ירדה באופן דרסטי או אבדה לחלוטין, מה שדרש הפשרת זן חדש ממלאי קפוא. הירידה הנצפית בפלואורסצנציה יכולה להיות תוצאה של שינויים גנטיים המדכאים טרנסגנים רעילים, כמו אלה המבטאים פולי-קיו. עם זאת, יכולת השחזור יוצאת הדופן של התוצאות שנצפו בין נסיינים שונים (איור משלים 2), בין שכפולים ביולוגיים (איור 5), ובתוך אותה דגימה (איור משלים 3) מדגישה את חוזקה של גישה זו.
דיווחים רבים השתמשו בפולי-Q במעיים כדי לחקור פרוטאוסטזיס 9,11,12,13,24,25. עם זאת, השוואה ישירה בין התוצאות אינה יכולה להיעשות בשל שונות בין גישות ניסיוניות ושיטות קריאה. עם זאת, כמה תוצאות מנתונים שפורסמו בעבר מסוכמות על ידי הכימות האוטומטי המתואר כאן, כולל אינדוקציה חיידקית של צבירה 9,13 ומספר דומה של אגרגטים11. באופן קולקטיבי, הצינור המתואר מציע כלי רב ערך לחקר פרוטאוסטזיס.
לשיטה המתוארת כאן יש כמה אתגרים מובנים. לדוגמה, זה דורש מספיק זמן כדי לשלוט בכל הרכיבים של פרוטוקול זה, וזה נכון במיוחד עבור סעיף 8 של הפרוטוקול, אשר דורש היכרות עם הבדיקה כדי לקבוע אם התמונות שנרכשו מתאימות לניתוח צינור. סטיות מהגדרות רכישת התמונה המשמשות בפרוטוקול זה אפשריות; עם זאת, סביר להניח שיידרש שינוי של ההגדרות וערכת האימונים של התולעים. צינור זה יכול להבחין בין אגרגטים בגדלים שונים לבין אלה שנוגעים בהם, מה שמגביל את “המיזוג” של אגרגטים ובסופו של דבר מגביר את רגישות הזיהוי. עם זאת, בעיות עלולות להתעורר בעת ניסיון לזהות אגרגטים גדולים החורגים מטווח הגודל המקובל, שכן הרחבת סף הגודל העליון עלולה להוביל לשגיאות הנגרמות על ידי זיהוי לקוי, כגון חוסר היכולת להבחין בין אגרגטים שנוגעים ללב. יש למצוא איזון בין דיוק, גודל ועוצמה לפני ניתוח התמונה. ניתן לשפר עוד יותר את היעילות של זיהוי הצבירה על ידי שילוב למידת מכונה ליצירת רשת עצבית המסוגלת לשפר את זיהוי הצבירה. שיפורים כאלה נבחנים כעת ויסייעו מאוד לטפל בבעיות אקטואליות כגון זיהוי אגרגטים הנמצאים במישורי מוקד שונים או בעלי צורות חריגות.
אחת החולשות הבולטות של השיטה המתוארת היא השונות בספירת אגרגטים אוטומטית, שכן הן לא תמיד משוחזרות על ידי ספירות ידניות בתולעים הניזונות מזני חיידקים שונים. לדוגמה, בהתבסס על ספירות אוטומטיות, לתולעים שניזונו ממוטציה P. aeruginosa 53 (M53) היו הרבה פחות אגרגטים בהשוואה לזן מסוג בר (MPAO1) (איור 7); עם זאת, אישור הפגיעה לא הראה הבדל משמעותי (איור משלים 4). באופן כללי, למסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה יש שיעור גבוה של זיהוי פגיעות חיוביות כוזבות, והשיטה המתוארת אינה יוצאת דופן26. לפיכך, זהו חלק קריטי בפרוטוקול כדי לאשר את כל הפגיעות הפוטנציאליות.
בעוד שפרוטוקול זה הותאם כך שיתאים לאסטרטגיית סינון לזיהוי חיידקים המשפיעים על פרוטאוסטזיס מארח, ניתן לשנות כל שלב עוד יותר כדי לבחון את ההשפעה של ספריות RNAi גנומיות, מולקולות קטנות או תנאים אחרים. ניתן לבצע שינויים נוספים בכל שלב כדי להתאים לדרישות של אסטרטגיית סינון ספציפית. יתר על כן, טכניקה זו מספקת רמה של גמישות המאפשרת אופטימיזציה של כל שלב כך שתתאים למודל מסוים. לדוגמה, ניתן להרחיב גישה זו לצבירת polyQ ברקמות אחרות או לחילוץ תכונות אחרות שזוהו בתמונות כגון ניטור ביטוי גנים באמצעות כתבים פלואורסצנטיים בלתי ניתנים להשראה (למשל, גנים של הלם חום), הערכת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים (למשל, לוקליזציה גרעינית של DAF-16), חקר צבירה במודלים אחרים של מחלות (Aβ1-42, α-סינוקלאין, TDP-43 וכו ‘) או הערכת פנוטיפים פיזיולוגיים, כגון גודל תולעת.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1RO3AG069056-01) והאגודה למחלות זיהומיות של אמריקה המממנת ל- DMC. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד. אנו מודים לחברי מעבדת Czyz על ההגהה של כתב היד. דמויות מצוירות נוצרו באמצעות רישיון בתשלום של BioRender.
Materials
| 1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
| 10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
| 15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
| Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
| BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
| Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
| C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
| C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
| CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
| Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
| CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
| 16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
| Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
| Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
| GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
| Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
| Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
| K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
| KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
| LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
| Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
| Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
| Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
| Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
| MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
| Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
| NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
| NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
| Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
| Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
| Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
| Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
| Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
| Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
| TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
| Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
| Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |
References
- Soto, C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).
- Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk. Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).
- Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. Our gut microbiome: The evolving inner self. Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).
- Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Walker, A. C., et al. Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate. PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).
- Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).
- Hakim, A., et al. WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms. BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).
- Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).
- Schulenburg, H., Ewbank, J. J. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).
- Shinn-Thomas, J. H. Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth. BMC Research Notes. 12 (1), (2019).
- Alexander-Floyd, J., et al. Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans. BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. False positives in the early stages of drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).
