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Biology

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

Published: October 14, 2021
doi:
10.3791/62997
, , , , ,
1Department of Microbiology and Cell Science,University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering,University of Florida

Summary

Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Hochdurchsatz-Workflows für die Wurmkultivierung, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutaminaggregaten als Bewertung von Veränderungen der Proteostase.

Abstract

Ein Anstieg der Prävalenz neurodegenerativer Proteinkonformationskrankheiten (PCDs) hat im Laufe der Jahre ein großes Interesse an diesem Thema geweckt. Diese erhöhte Aufmerksamkeit hat die Diversifizierung und Verbesserung von Tiermodellen gefordert, die in der Lage sind, Krankheitsphänotypen zu reproduzieren, die bei Menschen mit PCD beobachtet wurden. Obwohl sich Murine-Modelle als unschätzbar wertvoll erwiesen haben, sind sie teuer und werden mit mühsamen Methoden mit niedrigem Durchsatz in Verbindung gebracht. Die Verwendung des Nematodenmodells Caenorhabditis elegans zur Untersuchung von PCDs wurde durch die relative Wartungsfreundlichkeit, die niedrigen Kosten und die schnelle Erzeugungszeit gerechtfertigt, die Anwendungen mit hohem Durchsatz ermöglichen. Darüber hinaus macht die hohe Konservierung zwischen den C. elegans und dem menschlichen Genom dieses Modell zu einem unschätzbaren Entdeckungswerkzeug. Nematoden, die fluoreszierend markierte gewebespezifische Polyglutamin (PolyQ)-Trakte exprimieren, weisen eine alters- und polyQ-längenabhängige Aggregation auf, die durch fluoreszierende Herde gekennzeichnet ist. Solche Reporter werden oft als Stellvertreter eingesetzt, um Veränderungen in der Proteostase im gesamten Gewebe zu überwachen. Die manuelle Aggregatquantifizierung ist zeitaufwändig und begrenzt den experimentellen Durchsatz. Darüber hinaus kann die manuelle Quantifizierung von Schwerpunkten zu Verzerrungen führen, da die aggregierte Identifizierung sehr subjektiv sein kann. Hierin wurde ein Protokoll, bestehend aus Wurmkultivierung, Bildaufnahme und Datenverarbeitung, standardisiert, um eine Aggregatquantifizierung mit hohem Durchsatz unter Verwendung von C. elegans zu unterstützen, die darmspezifische PolyQ exprimieren. Durch die Implementierung einer C. elegans-basierten Bildverarbeitungspipeline mit CellProfiler, einer Bildanalysesoftware, wurde diese Methode optimiert, um einzelne Würmer zu trennen und zu identifizieren und ihre jeweiligen Aggregate aufzulisten. Obwohl das Konzept der Automatisierung nicht völlig einzigartig ist, ist die Notwendigkeit, solche Verfahren für die Reproduzierbarkeit, die Beseitigung von Verzerrungen aus der manuellen Zählung und die Erhöhung des Durchsatzes zu standardisieren, hoch. Es wird erwartet, dass diese Methoden den Screening-Prozess großer bakterieller, genomischer oder Arzneimittelbibliotheken unter Verwendung des C. elegans-Modells drastisch vereinfachen können.

Introduction

Altersabhängige neurodegenerative Proteinkonformationskrankheiten (PCDs) wie Alzheimer, Parkinson und Huntington oder amyotrophe Lateralsklerose sind durch Proteinfehlfaltung gekennzeichnet, die zu Aggregation, Zelltod und Gewebedegeneration führt1. Während die Fehlfaltung von Proteinen als Schuldiger erkannt wird, ist die Ätiologie dieser Krankheiten nicht klar. Daher wurde die Entwicklung wirksamer Therapien durch das mangelnde Wissen über die Faktoren und Bedingungen, die zum Ausbruch und Fortschreiten der Krankheit beitragen, behindert. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Veränderungen im Mikrobiom den Beginn, das Fortschreiten und den Schweregrad von PCDs beeinflussen 2,3,4. Die Komplexität des menschlichen oder sogar murinen Mikrobioms macht es jedoch schwierig, Studien durchzuführen, die den genauen Einfluss von Mikroben auf ihren Wirt aufdecken würden. Daher werden einfachere Organismen, wie Caenorhabditis elegans, oft als Entdeckungswerkzeugverwendet 5,6,7,8. Neuere Studien haben C. elegans verwendet, um die Wirkung von Bakterien auf die Wirtsproteostase und Krankheitspathogenese zu untersuchen 9,10. Bakterielle Besiedlung, Hormesis und genomische Veränderungen gehören zu den beispielhaften Bedingungen, die die Aggregation von Polyglutamin (PolyQ) -Trakten beeinflussen 9,11,12. Darüber hinaus weisen diese fehlgefalteten Proteincluster eine polyQ-längen- und altersabhängige Akkumulation innerhalb des Wirts auf und sind mit einer beeinträchtigten Motilitätassoziiert 9,13. Der relativ einfache Ansatz der Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Puncta kann wichtige Daten über Bedingungen, Faktoren oder Medikamente generieren, die die Proteinfaltung und -aggregation beeinflussen.

Obwohl sich die Quantifizierung fluoreszierender Puncta als zuverlässiges und relativ einfaches Verfahren erwiesen hat, bleibt die Herausforderung bestehen, ein Protokoll zu entwickeln, das ein groß angelegtes Screening von Verbindungen, Bakterien oder Bedingungen, die die Proteinaggregation beeinflussen, erleichtern würde. Das Konzept der automatisierten C. elegans-Bildverarbeitung und Puncta-Quantifizierung ist nicht ganz neu, da eine Reihe praktischer Unterstützungswerkzeuge entwickelt wurden14,15. Die Integration von Kultur, Bilderfassung und einer Verarbeitungspipeline ist jedoch unerlässlich, um die Variabilität der Ergebnisse zu eliminieren und Bildschirme mit höherem Durchsatz zu ermöglichen.

Daher besteht die Absicht dieses Manuskripts darin, das Verfahren zur Quantifizierung der PolyQ-Aggregation in C. elegans als Proxy zur Erkennung von Veränderungen in der Proteostase zu standardisieren. Diese Aufgabe wurde durch den Einsatz von CellProfiler erfüllt, einer Open-Source-Bildanalysesoftware16 , die zur automatisierten Identifizierung von Würmern und Aggregaten fähig ist und in ein größeres Protokoll für die Kultivierung von Würmern, die Erfassung von Bildern und die Verarbeitung von Daten integriert ist.

Protocol

Alle Verfahren folgten den Sicherheitsrichtlinien, die vom Institutional Biosafety Committee der University of Florida überprüft und genehmigt wurden. Es wurden geeignete Maßnahmen zur biologischen Sicherheit ergriffen, um das Risiko einer Exposition gegenüber Bakterien der Biologischen Sicherheitsstufe 2 zu verringern. HINWEIS: Für alle Experimente muss C. elegans auf Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten vermehrt und aufrechterhalten werden, die mit Escherichia coli OP50 besät sind. 1. Vorbereitung von 10 cm NGM-Platten Kombinieren Sie 3 g NaCl, 2,5 g Trypticase-Pepton und 17 g Agar zu einem 2-Liter-Kolben und füllen Sie ihn mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) auf 1 L. Fügen Sie vor dem Autoklavieren einen magnetischen Rührstab hinzu. Autoklavieren Sie die Mischung für 45 min bei 121 °C und einem Druck von 21 psi. Die Mischung im Wasserbad auf 50 °C abkühlen lassen. Unter Verwendung aseptischer Techniken fügen Sie die folgenden sterilen Lösungen hinzu: 1 ml von 1 M CaCl2· 2H2O, 1 ml von 1 m MgSO4· 7H2O, 1 ml 5 mg/ml Cholesterin gelöst in 100% Ethanol (erwärmt auf Raumtemperatur) und 25 ml 1 M KH2PO 4 (pH = 6,0). Mit einer magnetischen Rührplatte mischen. Das Mischen kann für 1 min bei 700 RPM durchgeführt werden. Gießen, bis die Mischung den gesamten 10 cm großen Teller ausfüllt. Alternativ können Sie eine abgestufte serologische Pipette verwenden, um etwa 20 ml Mischung pro Platte hinzuzufügen. Lassen Sie die Platten vor der Aussaat mit Bakterien 24 h bei Raumtemperatur trocknen oder lagern Sie die einfachen Platten nach dem Trocknen bei 4 °C.HINWEIS: Alle Medienkomponenten werden mit aseptischen Techniken behandelt. Die Schritte 1.3-1.4 sollten in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. 2. Herstellung von NGM-Agar mit FUDR in 24-Well-Platten Führen Sie die Schritte 1.1-1.3 aus. Ergänzen Sie NGM mit 5-Fluor-2′-Desoxyuridin (FUDR) und mischen Sie, um eine Endkonzentration von 100 μg/ml zu erreichen.HINWEIS: FUDR hemmt die DNA-Replikation und blockiert infolgedessen die Fortpflanzung von C. elegans , indem es auf Keimbahn und Embryogenese abzielt und letztendlich die Lebensdauer beeinflusst. Daher ist es wichtig, dass sich Würmer vollständig zu jungen Erwachsenen entwickeln können, bevor sie auf FUDR-haltige Platten übertragen werden.ACHTUNG: FUDR ist giftig und sollte gemäß dem Sicherheitsdatenblatt des Herstellers gehandhabt werden. Dosieren Sie mit einer Pipettenpistole 1 ml NGM-FUDR in jedes Bohrloch.HINWEIS: Dieser Prozess kann durch den Einsatz eines automatisierten Plattengießsystems erleichtert werden. Lassen Sie die Platte 24 h bei Raumtemperatur trocknen, bevor sie mit Bakterien ausgesät oder glatte Platten bei 4 °C gelagert werden. 3. Aussaat von Platten: OP50 und zusätzliche Testbakterien Um eine E. coli OP50-Kultur über Nacht herzustellen, fügen Sie 200 μL eines bakteriellen Aliquots aus einer gefrorenen Brühe in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit 250 ml frischer, steriler Luria-Brühe (LB) hinzu.HINWEIS: Das Volumen des Mediums hängt von der Anzahl der Platten ab, die ausgesät werden müssen. Um andere Bakterienkulturen herzustellen, impfen Sie ein 16-ml-Kulturröhrchen mit 5 ml Wachstumsmedium mit Bakterien aus gefrorenem Material mit einer sterilen Mikropipettenspitze. Inkubieren Sie über Nacht in einem 37 °C Inkubator und schütteln Sie mit 220 U / min (Umdrehungen pro Minute).HINWEIS: Verwenden Sie sterilisierte Kolben mit mindestens dem doppelten Arbeitsvolumen der Medien und versiegeln Sie mit autoklavierter Aluminiumfolie. Führen Sie den Impfschritt und die bakterielle Dosierung mit aseptischen Techniken durch. Geben Sie 1-2 ml der E. coli OP50-Kultur über Nacht auf die Mitte jeder 10 cm großen NGM-Platte. Diese Kultur muss nicht um die NGM-Platte verteilt werden. Lassen Sie die Platten vor dem Gebrauch/der Lagerung bei Raumtemperatur trocknen.HINWEIS: Ausgesäte Platten mit Deckeln können in eine Haube mit Luftstrom gelegt werden, um das Trocknen zu erleichtern. 4. Kultivierung und Aussaat von Tellern: 24-Well-Platten Bereiten Sie über Nacht eine Kultur der gewünschten Bakterienstämme vor und halten Sie sich an die Kultivierungsanweisungen in den Schritten 3.1-3.2. Übertragen Sie 200 μL jeder Bakterienkultur in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die NGM-Agar enthält. Ein Bakterienvolumen von 200 μL bedeckt den gesamten Agarbereich und maximiert die Nahrungsmenge, um sicherzustellen, dass Würmer den Bakterienrasen nicht meiden. Lassen Sie die Platten in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) aufgerissen, um das Trocknen zu erleichtern. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig, um eine übermäßige Austrocknung zu verhindern, und ändern Sie die Ausrichtung der Platte, um einen gleichmäßigen Luftstrom und eine gleichmäßige Trocknung zu fördern. Die Platten sollten innerhalb von 5 h trocknen.HINWEIS: Jede Arbeit mit Bakterien der biologischen Sicherheitsstufe 2 muss in zertifizierten BSCs durchgeführt und vom Institutional Biosafety Committee genehmigt werden. 5. Alterssynchronisation HINWEIS: Alle Schritte sollten mit geeigneten aseptischen Techniken durchgeführt werden (d. H. Arbeiten in der Nähe einer Flamme oder in einem BSC). Waschen Sie gravide Hermaphroditen von 10 cm OP50-Platten mit filtersterilisierter M9-Lösung (5,8 g Na2HPO4· 7H2O, 3,0 g KH 2 PO 4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO4·7H2O, in 1 L ddH 2O). Pipettenlösung M9 mehrmals mit einer sterilen serologischen Pipette aus Glas oder Kunststoff auf die Platte, um Würmer aus dem Bakterienrasen zu heben. Sammeln Sie die Schneckensuspension und geben Sie die Lösung in ein 15 ml Polystyrol-Konusrohr. Zentrifuge bei 270 x g, Raumtemperatur (RT, ~23 °C), für 2 min. Mit einem Vakuumfangskolben absaugen und den Überstand entsorgen, wobei das Wurmpellet ungestört bleibt. Schwebe das Pellet in 5-10 ml M9, um die Würmer zu waschen, und wiederhole die Schritte 5.2-5.3 zweimal. 5 ml 20%ige Bleichlösung (8,25 ml ddH2O, 3,75 ml 1M NaOH, 3,0 ml nicht-keimtötendes Bleichmittel) in das Rohr geben und kontinuierlich umkehren, um die Würmer aufzulösen. Würmer sind bereit zum Zentrifugieren, sobald sie sich fast vollständig aufgelöst haben.HINWEIS: Die Bleichzeiten und das Volumen der Bleichlösung hängen von der Größe der Probe ab. Über- und Unterbleichen sind häufige Fehler. Daher erfordert dieser Prozess im Allgemeinen eine Optimierung, um festzustellen, wann die Probe für die Zentrifugation bereit ist. Zentrifuge für 2 min bei 423 x g und den Überstand entsorgen. Fügen Sie 10 ml steriles M9 hinzu, um das Eipellet zu resuspendieren. Zentrifen Sie das Röhrchen für 2 min bei 423 x g , um die Eier zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspiratorkolben. Wiederholen Sie die Schritte 5.6-5.6.1. Schwebe das Eipellet in 5 ml sterilem M9 und lege es über Nacht bei der gewünschten Temperatur auf einen Nutator.HINWEIS: Alterssynchronisierte L1-Larven können am nächsten Tag auf Platten übertragen werden. 6. Wurmvorbereitung nach der Alterssynchronisation Zentrifen Sie die alterssynchronisierten Schnecken bei 270 x g für 3 min bei RT (~23 °C). Saugen Sie den Überstand in einer sauberen Umgebung ab, z. B. in einer Durchflusshaube oder neben einem Bunsenbrenner. Lassen Sie etwa 200 μL des Überstands stehen und suspendieren Sie die Würmer. Übertragen Sie die konzentrierte Wurmsuspension mit einer Mikropipette auf 10 cm große NGM-Platten, die zuvor mit OP50 ausgesät wurden.HINWEIS: Jede Platte kann 1.500 Würmer aufnehmen, ohne dass ihnen die Nahrung ausgeht. Diese Konzentration kann jedoch je nach Dichte des Bakterienrasens und Wachstumstemperatur angepasst werden müssen. Es wird empfohlen, mehrere Platten zu verwenden, um zu verhindern, dass Würmer verhungern. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Platten kein FUDR enthalten dürfen. Lassen Sie die Platten trocknen; dann invertieren und bei 25 °C für 48 h lagern.HINWEIS: Je nach Zustand des Bildschirms können Würmer aus Schritt 6.1 direkt auf Testplatten (die Bakterien, Medikamente oder Testverbindungen enthalten) platziert werden. Wenn die gewünschte Testbedingung die Entwicklung beeinflusst, sollten Würmer bis zu jungen Erwachsenen (~ 48 h) auf NGM, das OP50 enthält, kultiviert werden, bevor sie Testbedingungen ausgesetzt werden. Nach der 48-stündigen Inkubation waschen Sie die Würmer mit steriler M9-Lösung von den Platten und legen Sie sie in konische Röhrchen.HINWEIS: Erwachsene Würmer sinken auf den Boden der Röhre. Die genaue Zeit hängt von der Anzahl der Würmer ab, die aus 10-cm-Platten gewonnen wurden. Unter diesen Bedingungen setzen sich die Würmer innerhalb von 10 Minuten ab. Führen Sie eine Sichtprüfung durch, um die Dauer der Setzzeit so zu bestimmen, dass alle verbleibenden Eier oder geschlüpften Larven entfernt werden. Fügen Sie zusätzliche 10 ml M9 hinzu, um die verbleibenden Bakterien aus Wurmkörpern zu spülen. Die Schnecken für 2-3 min bei 270 x g bei 23 °C zentrifugieren. Führen Sie den Waschschritt weitere 3 Mal durch. Für beste Ergebnisse lassen Sie nach der endgültigen Wäsche etwa 1-1,5 ml M9-Lösung im Röhrchen. Übertragen Sie 10 μL der Schneckenaufhängung auf einen Glasobjektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Stellen Sie die Wurmdichte auf ca. 150 Würmer pro 10 μL M9 ein. Die Konzentration von Würmern in Suspension kann durch Entfernen oder Zugabe von M9-Lösung nach der Zentrifugation eingestellt werden. Bestätigen Sie, dass die gewünschte Konzentration ermittelt wurde, indem Sie die Anzahl der Durchschnittswerte aus mehreren verschiedenen Tropfen ermitteln. Es wird empfohlen, durchschnittliche Zählungen von mindestens drei Tropfen zu erzielen. Unter Verwendung aseptischer Techniken werden 10 μL der Wurmsuspension mit etwa 150 Würmern in jede Vertiefung der Prüfplatte übertragen. Untersuchen Sie die Vertiefungen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass jeder eine ausreichende Anzahl von Würmern hat. Zusätzliche Würmer können vor der Inkubation hinzugefügt werden. Lassen Sie die Platten ca. 10 min trocknen; und dann invertieren und für 72 h in einen 25 °C Inkubator überführen.HINWEIS: Die endgültige Inkubationszeit kann an die Bedürfnisse des Experiments angepasst werden. Die Inkubationszeit von 72 h reicht aus, um das Wachstum von 150 Tieren zu unterstützen, die sich von 200 μL-Bakterien in einer 24-Well-Platte bei 25 °C ernähren. 7. Würmer für die Bildgebung vorbereiten Um ein effektiveres Absetzen zu erleichtern und den Probenverlust zu minimieren, immobilisieren Sie die Würmer vor dem Waschen, um ein Schwimmen zu verhindern.HINWEIS: Wenn mit wenigen Proben gearbeitet wird, kann dies durch Exposition gegenüber Levamisol (100 μM) erreicht werden. Wenn Sie jedoch mit einer großen Anzahl von Proben arbeiten, können Würmer durch Einfrieren immobilisiert werden. Darüber hinaus verhindert ein verlängertes Einfrieren (18-24 h) die weitere Entwicklung von PolyQ-Aggregaten während der Herstellung. Platzieren Sie Multi-Well-Platten bei -20 °C für 15-20 min oder bis sich Würmer nicht mehr bewegen. Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie 5 Minuten ruhen. Fügen Sie mit einer Mikropipette 1 ml M9, gekühlt auf 4 ° C, zu einem Brunnen von Interesse hinzu, drücken und drücken Sie den Kolben wiederholt 4-6 Mal, um die Würmer in jedem Brunnen zu waschen.HINWEIS: Manchmal können Würmer an Mikropipettenspitzen haften. Daher sollten zwischen jedem Brunnen unterschiedliche Spitzen verwendet werden, um das Mischen von Würmern zu verhindern. Übertragen Sie die Schneckensuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie die Würmer auf den Boden sinken. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn. Waschen Sie die Probe insgesamt dreimal. Nachdem sich die Würmer während der letzten Wäsche auf dem Boden abgesetzt haben, aspirieren Sie 500 μL Überstand, so dass 500 μL übrig bleiben, um Würmer zu resuspendieren. Übertragen Sie die restliche Schneckenaufhängung auf eine neue flache 24-Well-Platte und legen Sie sie für 48 Stunden in einen Gefrierschrank von -20 °C.HINWEIS: Das Einfrieren von Würmern reduziert die Hintergrundfluoreszenz und ermöglicht eine bessere Visualisierung von Aggregaten. 8. Bildgebung 9. Bildanalyse Um die CellProfiler-Bildanalysepipeline zu verwenden, benennen Sie die Bildpaare ordnungsgemäß. Verwenden Sie das folgende Format: P1_A01_S1_C1, wobei sich P1 auf die spezifische Platte und ihre jeweilige numerische Bezeichnung bezieht; “A” bezieht sich auf die Zeile und “01” auf die Spalte; “S” bezieht sich auf ein bestimmtes Bildpaar für eine einzelne Vertiefung; “C” bezieht sich auf den Kanal, wobei “1” verwendet wird, um Hellfeldbilder und “2” für fluoreszierende Bilder zu bezeichnen. Laden Sie CellProfiler (Version 4.1.3 oder höher) von der offiziellen Website17 herunter. Laden Sie die Pipeline herunter (Ergänzende Datei 1). Laden Sie die Pipeline (Pipeline) in CellProfiler hoch, indem Sie Datei > > Pipeline aus Datei importieren auswählen.HINWEIS: Die Module 2 und 3 wurden deaktiviert, da sie als unnötig erachtet wurden. Ihre Funktion kann wiederhergestellt werden, wenn die Bildanalyse keine zufriedenstellende Trennung und Identifizierung von Würmern ergibt; Es ist jedoch eine Änderung der Pipeline erforderlich. Um diese Module zu integrieren, aktivieren Sie die Kontrollkästchen links neben jedem Modul. Benennen Sie das binäre Eingabebild für das Modul “UntangleWorms” in das Ausgabebild aus dem Modul “convertobjectstoimage” um. Bei der ersten Verwendung im Zusammenhang mit Modul 2 kann eine Fehlermeldung angezeigt werden. Fahren Sie in diesem Fall mit der Analyse fort. Laden Sie ein Trainingsset zur Identifizierung von Würmern in das Modul “UntangleWorms” hoch. Dieses Trainingsset finden Sie in der Ergänzungsdatei 2. Wählen Sie das Modul UntangleWorms aus, um die Einstellungen zu öffnen. Identifizieren Sie den Namen der Trainingssatzdatei und wählen Sie das Symbol zum Hochladen der Datei. Laden Sie die Zusatzdatei 2 (Trainingssatz) hoch. Wählen Sie vor der Analyse der Bilder den gewünschten Ausgabeordner aus, der zum Speichern der Ergebnisse verwendet werden soll. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabeeinstellungen in der Nähe der unteren linken Ecke des Programms. Wählen Sie das Ordnersymbol rechts neben Standardausgabe aus, um den gewünschten Ausgabespeicherort auszuwählen. Wählen Sie das Symbol Bilder analysieren aus, um mit der Bildanalyse zu beginnen. Wenn die Analyse zu lange dauert und bei der Verarbeitung eines einzelnen Bildes stecken bleibt, liegt dies wahrscheinlich an Problemen bei der Bildaufnahme. In diesem Fall brechen Sie die Ausführung ab und fahren Sie fort, um die unverarbeiteten Bilder zu identifizieren, indem Sie den Ausgabeordner sortieren und notieren, welche Bildnamen nicht gefunden werden.HINWEIS: Die Bilder erfordern möglicherweise zusätzliche Verarbeitung, um große oder intensiv beleuchtete Artefakte zu entfernen, die von der Pipeline nicht verarbeitet werden können. In einigen Fällen müssen solche Bilder möglicherweise von der Analyse ausgeschlossen werden. Nach vollständiger Analyse organisiert die Software die Ergebnisse in einer Excel-Tabelle, die einzelne Würmer (Spalte N) und ihre jeweilige Anzahl von Aggregaten (Spalte K) enthält.HINWEIS: Ein erfolgreicher Lauf erzeugt eine Excel-Tabelle, die die Anzahl der Aggregate pro identifiziertem Wurm für jedes Bohrloch enthält. Diese Daten können auf eine vom Experimentator festgelegte Weise manipuliert werden. Laden Sie Metadata Organizer (Graphical User Interface) aus Supplemental File 3 (Windows) oder Supplemental File 4 (Mac) herunter, um Daten aus der CSV-Ausgabedatei von CellProfiler bequem zu organisieren.HINWEIS: Diese Software hat keine offizielle Lizenz und wird nach dem Herunterladen nicht automatisch geöffnet. Führen Sie die Schritte 9.14-9.17 aus, wenn Sie das Windows-Betriebssystem 64-Bit verwenden. Die Software funktioniert nicht unter Windows 32-Bit. Befolgen Sie die Schritte 9.18-9.20, wenn Sie Mac OS verwenden. Die Schritte 9.21-9.22 sind für beide Betriebssysteme identisch. Suchen Sie unter Windows die heruntergeladene Datei und extrahieren Sie sie an den gewünschten Speicherort. Suchen und öffnen Sie den extrahierten Ordner mit dem Namen gui_windowsOS_64x und starten Sie die Anwendung, indem Sie auf das Anwendungssymbol “gui” klicken. Möglicherweise wird eine Eingabeaufforderung geöffnet, in der die Berechtigung zum Ausführen angefordert wird. Wählen Sie Weitere Informationen aus, und klicken Sie dann auf Trotzdem vertrauen. Suchen Sie unter Mac OS die heruntergeladene Datei und öffnen Sie gui_macOS_64x.zip. Dieser Schritt sollte automatisch alle Dateien extrahieren. Öffnen Sie den extrahierten Ordner unter “Downloads”. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Anwendung “gui” und wählen Sie Öffnen. Es erscheint eine Aufforderung, die Sie um Erlaubnis zum Öffnen bitten, da keine offizielle Lizenz vorhanden ist. Wählen Sie Öffnen aus, und fahren Sie mit Schritt 9.21 fort. Klicken Sie auf die Schaltfläche Organisieren , die den Benutzer zu einem neuen Bildschirm mit der Schaltfläche Dateien herunterladen führt. Klicken Sie auf die Schaltfläche und wählen Sie den gewünschten Speicherort aus, um die Ausgabedatei zu speichern. Die Ausgabedatei wird als ursprünglicher Dateiname angezeigt, wobei dem Dateinamen die Erweiterung “_organized” hinzugefügt wurde.

Representative Results

Hierin wird ein C. elegans-Workflow beschrieben, der Kultivierungs-, Bildaufnahme- und Verarbeitungsprotokolle umfasst, die die Beurteilung der PolyQ-Aggregation in Gegenwart verschiedener Bakterien unter Verwendung eines 24-Well-Plattenformats als Kultivierungs- und Bildgebungsplattform ermöglichen (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Wirkung von Bakterien, spezifischen Bedingungen, kleinen Molekülen, Medikamenten oder genomischen Manipulationen auf die Wirtsproteostase zu untersuchen. Die beschriebene Methode wurde unter Verwendung von Würmern optimiert, die intestinales PolyQ konstitutiv exprimieren, das mit einem gelb fluoreszierenden Protein verschmolzen ist (vha6p::p olyQ44::YFP); Aber auch andere Modelle, die über Proteostase in Muskeln oder Neuronen berichten, können mit weiterer Optimierung verwendet werden. Beispielsweise zeigen vorläufige Experimente die Anwendung dieser Methoden bei der Quantifizierung von Proteinaggregaten in anderen Geweben wie MuskelpolyQ (Ergänzende Abbildung 1). Es sind jedoch Änderungen an der Rohrleitung erforderlich, um sich ordnungsgemäß an die Gesamtgröße und Helligkeit anzupassen, wie in Abschnitt 8 HINWEIS erwähnt. Abbildung 1: Visuelle Darstellung des Workflows Die Hauptschritte des Protokolls umfassen fünf verschiedene Phasen: Wurmvorbereitung und Alterssynchronisation (Schritte 1-5), Darmbesiedlung / Wurmbehandlung (Schritt 6), Probenvorbereitung für die Bildgebung (Schritt 7), Bildaufnahme (Schritt 8) und Bildverarbeitung (Schritt 9). Die “Abschnitte” des Protokolls werden in der Abbildung als “Schritte” bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die ersten Optimierungsexperimente zeigten verschiedene Schwierigkeiten, die mit einer Überfüllung aufgrund einer großen Anzahl von Nachkommen verbunden waren, was zu einer schnelleren Nahrungserschöpfung führte. Die in Abschnitt 2 beschriebene Supplementierung von FUDR in NGM-Platten löste dieses Problem (Abbildung 2). Darüber hinaus hatten Würmer, die mit verschiedenen Bakterien gefüttert wurden, in Gegenwart von FUDR eine konsistentere Körpergröße, was eine gleichmäßigere und genauere Erkennung von Würmern ermöglichte. Abbildung 2: Die Verwendung von FUDR verbessert die Bildqualität durch Reduzierung der Nachkommenschaft. FUDR-supplementierte Platten eliminieren C. elegans Nachkommen im Vergleich zu Würmern, die auf NGM-Platten ohne FUDR-Kontrolle gezüchtet werden, die mit E. coli OP50 ausgesät sind. Die Bilder wurden mit einer 25,2-fachen Vergrößerung (40-fache Vergrößerung mit einem 0,63-fachen Kameraadapter) aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die Hintergrundfluoreszenz trug zur falsch positiven Detektion von PolyQ-Aggregaten bei. Um ein solches Fluoreszenzsignal im Darmtrakt zu reduzieren und die automatisierte Erkennung von Aggregaten zu verbessern, war es notwendig, Würmer vor der Bildgebung einzufrieren. Das Einfrieren von Würmern bei -20 °C für 18-48 h verbesserte die PolyQ-Aggregaterkennung signifikant durch Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz (Abbildung 3A). Das menschliche Auge ist in der Lage, zwischen Aggregaten und Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden; Daher ist die manuelle Zählung vor und nach dem Einfrieren gleich (Abbildung 3B). Die automatisierte Zählung ist jedoch nicht so genau, aber das Einfrieren verbesserte die automatisierten Zählungen mit einer Genauigkeit, die mit der manuellen Zählung vergleichbar ist (Abbildung 3B). Abbildung 3: Das Einfrieren verbessert die Aggregaterkennung. (A) Fluoreszierende Bilder von C. elegans, die das intestinale PolyQ44::YFP vor und nach dem Einfrieren exprimieren. Einsätze stellen Nahaufnahmen des ausgewählten Bereichs dar. Maßstabsstäbe = 500 μm. (B) Durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm bei Würmern, die vor und nach dem Einfrieren mit P. aeruginosa MPAO1 besiedelt sind, unter Verwendung einer manuellen oder automatisierten (Pipeline-) Aggregatquantifizierung. Die Daten stellen zwei biologische Replikate dar (n = 60-109). Die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test von Student (**** p < 0,0001) berechnet. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die invertierte Hellfeldbeleuchtung wurde verwendet, um den gesamten C. elegans (Abbildung 4A) und GFP-Kanal zu detektieren, um PolyQ44::YFP-Aggregate abzubilden (Abbildung 4B). Die Erkennung, Entwirrung und Aggregatquantifizierung von Würmern für jeden Wurm erfolgte durch Anwendung einer optimierten CellProfiler-Bildverarbeitungspipeline (Supplemental File 1), die es ermöglicht, die Anzahl der Aggregate pro individuellem Wurm zu ermitteln (Abbildung 4C-D). Um die Machbarkeit dieses Ansatzes und die Genauigkeit der automatisierten Aggregatdetektion und -quantifizierung zu testen, wurden Würmer, die darmspezifisches polyQ44::YFP exprimieren, kultiviert und für die Bildgebung gemäß den festgelegten Protokollen vorbereitet (Abschnitte 1-7). Die Anzahl der Aggregate pro Wurm wurde entweder mit Hilfe der automatisierten Pipeline (Abschnitte 8-9) oder der manuellen Zählung bewertet. Jedes Experiment wurde in drei unabhängigen Studien mit 90-571 Würmern pro Bedingung durchgeführt. Während die durchschnittliche Anzahl der Aggregate pro Darm, die mit zwei Studien erhalten wurden, keinen signifikanten Unterschied aufwies, hatten Würmer in der dritten Studie signifikant weniger Aggregate, wenn sie mit dem automatisierten Ansatz quantifiziert wurden (Abbildung 5A). Die durchschnittliche Anzahl der Aggregate aus den drei Studien führte zu leichten, aber signifikant weniger Aggregaten, wenn die Quantifizierung mit der CellProfiler-Pipeline durchgeführt wurde (Abschnitte 8-9) (Abbildung 5B). Dennoch war der Unterschied zwischen den beiden Ansätzen minimal, was darauf hindeutet, dass die automatisierte Methode auf großflächige Bildschirme angewendet werden kann. Abbildung 4: Aggregaterkennung mit CellProfiler. (A) Hellfeldbild, das zur Identifizierung von Wurmkörpern verwendet wird. (B) Originalfluoreszenzbild, das unter Verwendung des GFP-Kanals aufgenommen und zur Identifizierung und Quantifizierung einer Gesamtzahl von intestinalen PolyQ44::YFP-Aggregaten verwendet wurde. (C) Mit CellProfiler identifizierte Aggregate. (D) Eine Gesamtzahl der identifizierten Aggregate, die dem ursprünglichen fluoreszierenden Bild mit Wurm- und Aggregatumrissen überlagert sind. Die Bilderfassung und -verarbeitung erfolgte unter Verwendung der in den Abschnitten 8-9 beschriebenen Einstellungen. Die Panels E-H stellen Nahaufnahmen der entsprechenden umrissenen Bereiche in den Bildern A-D dar. Die Bilder wurden mit einer 25,2-fachen Vergrößerung (40-fache Vergrößerung mit einem 0,63-fachen Kameraadapter) aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Wirksamkeit der automatisierten Aggregatquantifizierung. (A) Durchschnittliche Aggregatanzahl pro Darm bei Würmern, die mit Kontroll-E. coli OP50 besiedelt sind, unter Verwendung manueller Zählung (manuell) und automatisierter CellProfiler-basierter Quantifizierung (Pipeline). Die Ergebnisse stellen Daten dar, die in drei separaten Studien (T1-T3) analysiert wurden (n = 90-571). (B) Die durchschnittliche Anzahl der Aggregate pro Darm wurde durch manuelle oder automatisierte (Pipeline-) Aggregatquantifizierung ermittelt. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des t-Tests von Student berechnet (* p < 0,05, ** p < 0,01). Fehlerbalken stellen REM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei verschiedenen Experimentatoren zu bewerten, wurden Bilder von einer Platte mit sechs Vertiefungen von Würmern, die entweder mit Pseudomonas aeruginosa MPAO1 oder Escherichia coli OP50 gefüttert wurden, von drei Personen aufgenommen, von denen zwei keine Erfahrung mit der Bildgebung von Würmern mit diesen Protokollen hatten. Bilder, die aus jedem Brunnen gesammelt wurden, enthielten zwischen 30 und 115 erkannte Würmer. Ein nicht signifikanter Unterschied in der Aggregation wurde bei Würmern aus denselben Bohrlöchern festgestellt, die von den drei Experimentatoren aufgenommen wurden. Während die durchschnittliche Anzahl der Aggregate pro Darm zwischen den drei Experimentatoren für Würmer, die mit MPAO1 und OP50 gefüttert wurden, sehr konstant blieb, gab es einige statistisch signifikante Unterschiede in der durchschnittlichen Anzahl der Aggregate, aber nur bei Würmern, die von MPAO1 besiedelt wurden (Ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse unterstreichen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auch zwischen unerfahrenen Experimentatoren. Um sicherzustellen, dass die Reproduzierbarkeit der Aggregatquantifizierung nicht signifikant von der Wurmposition beeinflusst wird, wurde ein Satz von 15 Würmern ausgewählt und 15 verschiedene Male nach dem Rühren zwischen jeder Bildaufnahme mit einer Pipettenspitze abgebildet. Bilder von Aggregaten in Würmern, die mit E. coli OP50 und P. aeruginosa MPAO1 gefüttert wurden, wurden mit CellProfiler gesammelt und analysiert. Die durchschnittliche Anzahl der Aggregate aus jedem dieser verschiedenen Bildsätze unterschied sich leicht, aber nicht signifikant, was die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes weiter unterstützt (Ergänzende Abbildung 3). Es wurde gezeigt, dass die Besiedlung des Darms von C. elegans mit gramnegativen enterischen Krankheitserregern die Proteostase im gesamten Gewebe stört, wobei P. aeruginosa zu den stärksten Induktoren der PolyQ-Aggregationgehört 9. Um festzustellen, ob diese optimierten Protokolle eine P . aeruginosa-vermittelte Verstärkung der Aggregation erfolgreich erkennen und quantifizieren werden, wurden Würmer, die intestinales PolyQ exprimierten, mit E. coli OP50 (Kontrollbakterien) besiedelt und P. aeruginosa MPAO1, Abschnitte 1-8, durchgeführt. Die aufgenommenen Bilder wurden mit CellProfiler analysiert (Abschnitt 9, Zusatzdatei 1). Die Ergebnisse der automatisierten Quantifizierung zeigen eine signifikante Zunahme der Anzahl der durch P. aeruginosa MPAO1 induzierten Aggregate, was im Vergleich zu Würmern, die mit Kontroll-E. coli OP50 gefüttert wurden, konsistent zu einer zweifachen Verbesserung führte (Abbildung 6). Abbildung 6: Die durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm bei Würmern, die mit Control E. coli OP50 und P. aeruginosa MPAO1 besiedelt sind. Die Anzahl der Aggregate pro Darm wurde mit CellProfiler bewertet (Abschnitte 8-9). Die Daten werden als durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm bei Würmern dargestellt, die mit OP50 (n = 1068) und MPAO1 (n = 1557) besiedelt sind. Die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test von Student (**** p < 0,0001) berechnet. Fehlerbalken stellen REM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Die optimierte Pipeline wurde entwickelt, um großflächige Bildschirme für Bedingungen zu unterstützen, die die Proteostase beeinflussen. Um die Durchführbarkeit dieses Ansatzes beim Screening großer Bakterienbibliotheken auf ihre Wirkung auf die Wirtsproteostase zu testen, wurde die hierin beschriebene Pipeline (Abschnitte 1-9) verwendet, um die Wirkung von 90 P. aeruginosa-nicht-essentiellen Gen-Knock-out-Mutantenstämmen auf die PolyQ-Aggregation18 zu testen. Dieser Pilotbildschirm ist Teil eines größeren Projekts, das entwickelt wurde, um alle nicht essentiellen Mutantenstämme von P. aeruginosa auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Proteostase des Wirts zu beeinflussen. Von 90 getesteten Bakterienstämmen zeigte die Besiedlung des Darms von C. elegans mit einem Kandidaten eine signifikante Abnahme der Anzahl der Aggregate (Abbildung 7). Folgeexperimente zur Bewertung der Sensitivität dieses Assays wurden über manuelle Aggregatzählungen aus einer zufälligen Auswahl von sechs P. aeruginosa-Mutanten durchgeführt, die sich nicht signifikant von der MPAO1-Kontrolle unterschieden. Diese Experimente wurden unter Verwendung der traditionelleren 6-cm-NGM-Platten durchgeführt, wobei Würmer als L1 auf Teststämme übertragen wurden, um zuvor etablierte Methoden9 zu rekapitulieren. Die Bestätigungsexperimente durch manuelle Zählung zeigten, dass keine der Mutanten, einschließlich derer, die die Anzahl der Aggregate signifikant verringerte (Abbildung 7), die PolyQ-Aggregation beeinflusste (Ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus wurden die subtilen Veränderungen in der Aggregation, die im Bildschirm der 90 mutierten Stämme beobachtet wurden, bei manuellen Zählungen ausgewählter Kandidaten nicht erkannt, was darauf hindeutet, dass solche Veränderungen aufgrund biologischer und experimenteller Variabilität, wie z. B. eines niedrigen n-Werts, auftreten könnten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass unsere Methode zwar zuverlässig signifikante Veränderungen aufnehmen kann, aber subtile Änderungen wahrscheinlich übersehen werden und alle potenziellen Kandidaten einzeln bestätigt werden müssen. Abbildung 7: Die Anzahl der Aggregate pro Darm in einem repräsentativen Stichprobensatz von Würmern, die von 92 Bakterienstämmen besiedelt sind. Die Daten werden als die durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm dargestellt, die auf die Anzahl der mit MPAO1 besiedelten Würmer normalisiert ist. Gepunktete Linien stellen die durchschnittliche Anzahl von Aggregaten in Würmern dar, die mit MPAO1 (oberer, offener Kreis) und OP50-Steuerung (unten, offenes Quadrat) besiedelt sind. Volumenkörpersymbole repräsentieren 90 verschiedene Knock-out-Mutantenstämme von P. aeruginosa MPAO1. Die durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Wurm zwischen Würmern, die mit MPAO1 besiedelt wurden, und einer einzelnen Mutante war statistisch signifikant. Graue Kreise stellen Proben dar, die manuell bestätigt wurden (Ergänzende Abbildung 4). Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) berechnet, gefolgt von einem mehrfachen Vergleich von Dunnetts Post-hoc-Test (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Fehlerbalken stellen REM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Um die große Datenmenge zu verwalten, die von CellProfiler generiert wird, wurde eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) entwickelt, um die Datenverarbeitung und -organisation zu automatisieren (Abbildung 8). Die GUI wurde mit Tkinter, einem plattformübergreifenden Open-Source-Python-Widget-Toolkit, entwickelt. Aus den angegebenen Metadaten extrahiert die Anwendung die Anzahl der Aggregate (Spalte K) aus jedem Bohrloch (Spalte J), das in einer Platte vorhanden ist. Eine Python-Datenverarbeitungsbibliothek namens “Pandas” wurde verwendet, um den oben genannten Prozess durchzuführen. Die GUI-Anwendung bietet Drag-and-Drop-Unterstützung für Benutzer zum Hochladen von Datendateien. Die Daten in jeder Datei werden in Form einer zweidimensionalen tabellarischen Struktur gespeichert, die als Datenrahmen bezeichnet wird. Ein leeres Wörterbuchpaar wird für jedes eindeutige Well, das innerhalb des Datenrahmens gefunden wird, initialisiert. Als nächstes werden die verschiedenen Aggregate, die in jedem Vertiefungsfeld gefunden werden, gezählt und an ihre jeweiligen Wörterbuchpaare angehängt. Die Spalte mit kleineren Daten wird mit leeren wertigen Zeichenfolgen aufgefüllt, um sicherzustellen, dass jede Spalte gleichmäßig groß ist. Schließlich wird die Struktur in einen Datenrahmen konvertiert, der in Form einer Tabellenkalkulation in das vom Benutzer angegebene Verzeichnis exportiert wird. Abbildung 8: Grafische Benutzeroberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1: Nachweis von muskelspezifischen PolyQ-Aggregaten. Würmer, die muskelspezifische polyQ35::YFP exprimierten, wurden als L1s plattiert und auf OP50 für 48 h kultiviert. Sobald sich Würmer zu jungen Erwachsenen entwickelten, wurden sie auf 24-Well-NGM-Platten übertragen, mit 100 μg / ml FUDR ergänzt und vor der Bildgebung für weitere 72 h mit MPAO1 ausgesät. (A) Hellfeldbild, das zur Identifizierung von Wurmkörpern verwendet wird. (B) Originalfluoreszenzbild, aufgenommen mit GFP-Kanal. (C) Mit CellProfiler identifizierte Aggregate. (D) Eine Gesamtzahl der identifizierten Aggregate, die dem ursprünglichen fluoreszierenden Bild mit Wurm- und Aggregatumrissen überlagert sind. Die Bilderfassung und -verarbeitung erfolgte unter Verwendung der in den Abschnitten 8-9 beschriebenen Einstellungen. Die Panels E-H stellen Nahaufnahmen der entsprechenden umrissenen Bereiche in den Bildern A-D dar. Maßstabsstäbe = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Reproduzierbarkeit der Aggregatquantifizierung zwischen verschiedenen Experimentatoren. Durchschnittliche Anzahl von Aggregaten, quantifiziert mit CellProfiler für sechs Vertiefungen von Würmern, die mit P. aeruginosa MPAO1 (schwarze Balken) besiedelt sind, und sechs Vertiefungen von Würmern, die mit Kontroll-E. coli OP50 (graue Balken) besiedelt sind. Jedes Bohrloch wurde von drei Experimentatoren (AVS, DMC, RDH) abgebildet. Die Daten werden als durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm dargestellt (n = 30-115). Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA berechnet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest (* p < 0,05, ** p < 0,01). Fehlerbalken stehen für SEM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 3: Der Einfluss der Wurmposition auf die Reproduzierbarkeit der Aggregatquantifizierung. Durchschnittliche Aggregatzahl pro Darm bei Würmern, die mit Kontroll-E. coli OP50 (graue Balken) und P. aeruginosa MPAO1 (schwarze Balken) besiedelt sind. Die Ergebnisse stellen die durchschnittliche Anzahl von Aggregaten pro Darm (15≥n≥12) dar, die mit CellProfiler quantifiziert wurden. Die Position der Würmer in den Brunnen wurde durch Rühren zwischen den einzelnen Akquisitionen verändert. In beiden Gruppen wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede gefunden. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA berechnet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Fehlerbalken stehen für SEM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 4: Bestätigung des Pilotbildschirms mit manueller Zählung. Die durchschnittliche Anzahl der Aggregate pro Darm wurde manuell quantifiziert. Die Daten stellen Aggregationsprofile von Würmern dar, die mit sechs MPAO1-Knock-out-Mutanten besiedelt sind (graue Kreise Abbildung 7) im Vergleich zu Wildtyp-MPAO1- und OP50-Kontrollen (n = 30). Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA berechnet, gefolgt von einem mehrfachen Vergleich von Dunnetts Post-hoc-Test (**** p < 0,0001). Fehlerbalken stehen für SEM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 5: Die Wirkung von FUDR auf die intestinale PolyQ-Aggregation. Die Daten werden als durchschnittliche Anzahl von polyQ44::YFP-Aggregaten pro Darm (n = 20) dargestellt. Würmer wurden nach 48 h Wachstum bei 25 °C auf E. coli OP50 auf Kontroll- (kein FUDR) oder FUDR-haltige Platten (100 μg /ml) übertragen. Manuelle Zählungen wurden nach weiteren 48 Stunden erhoben. Die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test von Student (ns = nicht signifikant) berechnet. Fehlerbalken stehen für SEM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 1: Proteostase-Pipeline. Herunterladbare Bildanalyse-Pipeline zur Verwendung in CellProfiler. Eine Anleitung zur Anwendung finden Sie in Abschnitt 9. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2: Trainingsset Entwirrungswurm. Datei, die in das Modul “UntangleWorms” hochgeladen werden soll. Dieses spezielle Trainingsset ist spezifisch für die Würmer, die im ersten Ansatz verwendet wurden. Änderungen in der Größe und Form des Wurms verändern die Genauigkeit und Qualität der Identifizierung. Es kann notwendig sein, eine personalisiertere Trainingsdatei zu erstellen. Anweisungen zum Erstellen eines neuen Trainingssets finden Sie auf der offiziellen CellProfiler-Website17. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 3: Grafische Benutzeroberfläche für Windows-Betriebssystem. gui_windowsOS_64x.zip. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 4: Grafische Benutzeroberfläche für Mac-Betriebssystem. gui_MacOS_64x.zip. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das beschriebene Protokoll beschreibt Verfahren für C. elegans Kulturierung, Bildgebung und Bildverarbeitung, die CellProfiler, eine Open-Source-Bildanalysesoftware, enthalten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen Reproduzierbarkeit, Reduzierung von Bias und Skalierbarkeit. Dieses standardisierte Verfahren wird die Screening-Strategien verbessern, die bei großen bakteriellen, genomischen oder Arzneimittelbibliotheken eingesetzt werden. Während andere automatisierte C. elegans-Methoden zur Objekterkennung existieren, bietet die beschriebene Technik eine standardisierte Pipeline mit höherem Durchsatz, die Kultur, Bildaufnahme und Analyse integriert.

Mehrere Variationen der Wurmzucht mussten getestet werden, um das hierin beschriebene Protokoll zu optimieren. Zunächst wurden Würmer unmittelbar nach der Alterssynchronisation (L1-Stadium) auf Probenbakterien übertragen. Ein solcher Ansatz führte jedoch zu einer Population von Würmern mit unterschiedlichen Größen, selbst zwischen Würmern innerhalb desselben Brunnens. C. elegans sind für die Vermeidung von Krankheitserregern19 bekannt, was zu der beobachteten Größenvariabilität beigetragen haben könnte und letztendlich insbesondere den nachgeschalteten Bildgebungs-Wurm-Nachweis beeinflusst haben könnte. Um eine solche Variabilität zu eliminieren, wurde der gesamte NGM-Bereich in jedem Bohrloch mit Testbakterien bedeckt. Darüber hinaus wurden die Würmer mit E. coli OP50 gefüttert und konnten sich 48 h bei 25 °C voll zu jungen Erwachsenen entwickeln. Würmern zu erlauben, das Erwachsenenalter auf E. coli OP50 zu erreichen, bevor sie auf Testbakterien übertragen wurden, führte zu einer konsistenteren Körpergröße. Darüber hinaus wurden Überfüllung und schnelle Nahrungserschöpfung durch Nachkommen durch die Ergänzung von NGM-Agar mit FUDR beseitigt. Die Implementierung von FUDR entfernte Nachkommen und verbesserte die automatisierte Wurmidentifikation, die durch die Vermischung der Nachkommen mit der elterlichen Bevölkerung verdeckt wurde. Es ist jedoch wichtig, vorsichtig zu sein und geeignete Kontrollen zu verwenden, wenn FUDR verwendet wird, da bekannt ist, dass die Verbindung C. elegans Proteostase und Lebensdauerbeeinflusst 20,21. Unter den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen hatte FUDR keinen Einfluss auf die intestinale PolyQ-Aggregation (Ergänzende Abbildung 5); Daher war seine Verwendung für die beschriebene Methode geeignet und vorteilhaft.

Das Einfrieren von Proben vor der Bildgebung erwies sich als kritischer Schritt für den erfolgreichen Einsatz der Pipeline. Die aggregierten Zahlen vor dem Einfrieren waren signifikant höher als die manuellen Zählungen (Abbildung 3B). Das Halten von Würmern bei -20 °C für 18-48 h vor der Bildgebung reduzierte die Hintergrundfluoreszenz und verbesserte letztendlich die Aggregaterkennung (Abbildung 3A). Die Auswirkungen des Einfrierens auf die Aggregatdetektion wurden nur für PolyQ untersucht und sollten nicht auf andere Modelle verallgemeinert werden, ohne weitere Untersuchungen solcher Effekte durchzuführen.

Obwohl alle Bedingungen gleich blieben, wurde beobachtet, dass die durchschnittliche Anzahl der Aggregate pro Wurm zwischen verschiedenen Läufen variieren konnte, während das Verhältnis zwischen der Anzahl der Aggregate bei Tieren, die mit OP50 besiedelt wurden, gegenüber MPAO1 konstant blieb (Abbildung 6, Ergänzende Abbildung 2, Ergänzende Abbildung 5). Daher ist es wichtig, E. coli OP50-Steuerung oder zusätzliche geeignete Referenzkontrollen immer in jeden Durchlauf aufzunehmen. Eine solche Variabilität der Aggregatzählungen zwischen den Experimenten könnte durch die Umgebungsbedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit)22,23 oder den genetischen Hintergrund8 beeinflusst werden. Tatsächlich wurde beobachtet, dass die Darmfluoreszenz nach längerer Kultur drastisch abnahm oder vollständig verloren ging, was das Auftauen eines neuen Stammes aus gefrorenem Bestand erforderte. Die beobachtete Abnahme der Fluoreszenz könnte ein Ergebnis genetischer Veränderungen sein, die toxische Transgene unterdrücken, wie sie beispielsweise PolyQ exprimieren. Nichtsdestotrotz unterstreicht die außergewöhnliche Reproduzierbarkeit der beobachteten Ergebnisse zwischen verschiedenen Experimentatoren (Ergänzende Abbildung 2), zwischen biologischen Replikaten (Abbildung 5) und innerhalb derselben Stichprobe (Ergänzende Abbildung 3) die Stärke dieses Ansatzes.

Zahlreiche Berichte haben intestinale PolyQ verwendet, um Proteostase 9,11,12,13,24,25 zu untersuchen. Ein direkter Vergleich zwischen den Ergebnissen kann jedoch aufgrund der Variabilität zwischen experimentellen Ansätzen und Auslesemethoden nicht durchgeführt werden. Nichtsdestotrotz werden einige Ergebnisse aus zuvor veröffentlichten Daten durch die hierin beschriebene automatisierte Quantifizierung rekapituliert, einschließlich der bakteriellen Induktion der Aggregation 9,13 und einer vergleichbaren Anzahl von Aggregaten 11. Insgesamt bietet die beschriebene Pipeline ein wertvolles Werkzeug, um Proteostase zu untersuchen.

Die hier beschriebene Methode hat einige inhärente Herausforderungen. Zum Beispiel erfordert es genügend Zeit, um alle Komponenten dieses Protokolls zu beherrschen, was insbesondere für Abschnitt 8 des Protokolls gilt, der Vertrautheit mit dem Assay erfordert, um festzustellen, ob die aufgenommenen Bilder für die Pipeline-Analyse geeignet sind. Abweichungen von den in diesem Protokoll verwendeten Bildaufnahmeeinstellungen sind möglich; Es ist jedoch wahrscheinlich eine Änderung der Einstellungen und des Wurmtrainingssatzes erforderlich. Diese Pipeline kann Aggregate unterschiedlicher Größe und solche, die sich berühren, unterscheiden, was das “Mischen” von Aggregaten einschränkt und letztendlich die Erkennungsempfindlichkeit erhöht. Beim Versuch, große Aggregate zu identifizieren, die den akzeptierten Größenbereich überschreiten, können jedoch Probleme auftreten, da das Erweitern des oberen Größenschwellenwerts zu Fehlern führen kann, die durch eine schlechte Identifizierung verursacht werden, z. B. die Unfähigkeit, berührende Aggregate zu unterscheiden. Vor der Bildanalyse muss ein Gleichgewicht zwischen Genauigkeit, Größe und Intensität gefunden werden. Die Effizienz der Aggregatidentifizierung könnte durch die Integration von maschinellem Lernen weiter verbessert werden, um ein neuronales Netzwerk zu schaffen, das die Aggregaterkennung verbessern kann. Solche Verbesserungen werden derzeit untersucht und werden bei der Lösung aktueller Probleme wie der Erkennung von Aggregaten, die auf verschiedenen Fokusebenen liegen oder abnormale Formen aufweisen, sehr hilfreich sein.

Eine bemerkenswerte Schwäche der beschriebenen Methode ist die Variabilität der automatisierten Aggregatzählungen, da sie bei Würmern, die mit unterschiedlichen Bakterienstämmen gefüttert werden, nicht immer durch manuelle Zählungen rekapituliert werden. Auf der Grundlage automatisierter Zählungen hatten beispielsweise Würmer, die mit der P. aeruginosa-Mutante 53 (M53) gefüttert wurden, im Vergleich zum Wildtypstamm (MPAO1) deutlich weniger Aggregate (Abbildung 7); Die Bestätigung des Treffers zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied (Ergänzende Abbildung 4). Im Allgemeinen haben Hochdurchsatz-Drogenscreenings eine hohe Rate an falsch-positiver Treffererkennung, und die beschriebene Methode ist keine Ausnahme26. Daher ist es ein kritischer Teil des Protokolls, alle potenziellen Treffer zu bestätigen.

Während dieses Protokoll optimiert wurde, um eine Screening-Strategie zur Identifizierung von Bakterien zu entwickeln, die die Proteostase des Wirts beeinflussen, kann jeder Schritt weiter modifiziert werden, um die Wirkung von genomischen RNAi-Bibliotheken, kleinen Molekülen oder anderen Bedingungen zu testen. In jedem Schritt können zusätzliche Änderungen vorgenommen werden, um den Anforderungen einer bestimmten Screening-Strategie gerecht zu werden. Darüber hinaus bietet diese Technik ein Maß an Flexibilität, das die Optimierung jedes Schritts für ein bestimmtes Modell ermöglicht. Beispielsweise kann dieser Ansatz auf die PolyQ-Aggregation in anderen Geweben oder die Extraktion anderer in Bildern erkannter Merkmale wie die Überwachung der Genexpression mit induzierbaren fluoreszierenden Reportern (z. B. Hitzeschockgene), die Beurteilung der subzellulären Lokalisation von Proteinen (z. B. die nukleare Lokalisation von DAF-16), die Untersuchung der Aggregation in anderen Krankheitsmodellen (Aβ1-42, α-Synuclein, TDP-43 usw.) oder die Beurteilung physiologischer Phänotypen, erweitert werden. wie z.B. Wurmgröße.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) und der Infectious Diseases Society of America unterstützt, die DMC finanzierten. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitgliedern des Czyz Lab für das Korrekturlesen des Manuskripts. Cartoon-Figuren wurden mit der kostenpflichtigen BioRender-Lizenz generiert.

Materials

1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP – MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube
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References

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Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., Walker, A. C., Pagolu, C. N., Enslow, S. M., Czyż, D. M. Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (176), e62997, doi:10.3791/62997 (2021).
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