Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi
Summary
Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Solunum yolu dış çevre ile doğrudan temas halindedir ve çevresel antijenlere karşı istenmeyen reaksiyonları bastırırken koruma sağlamak için hassas bir şekilde düzenlenmiş bir bağışıklık sistemi gerektirir. Akciğerler, immün sürveyans sağlayan, aynı zamanda koruyucu immün yanıtlara aracılık eden doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin çeşitli popülasyonlarına ev sahipliği yapar. Sağlıklı pulmoner bağışıklık sistemini dengede tutan bu hücreler, astım, enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlara da katılırlar. Yüzey ve hücre içi proteinlerin seçici ekspresyonu, akciğerin bağışıklık hücrelerine benzersiz immünofenotipik özellikler sağlar. Sonuç olarak, akış sitometrisi, kararlı durum ve patolojik durumlar sırasında bu tür hücre popülasyonlarının tanımlanmasında etkili bir role sahiptir. Bu makale, kararlı durum koşulları altında sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerini tanımlamak için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, akciğer bağışıklık manzarasındaki hastalığa özgü değişiklikleri tanımlamaya yardımcı olmak için çeşitli hastalık modellerinde bu hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için de kullanılabilir.
Introduction
Murin solunum yolu, patojenlerle savaşmaktan ve bağışıklık homeostazını korumaktan sorumlu benzersiz bir bağışıklık sistemi içerir. Pulmoner immün sistem, fenotipleri, fonksiyonları, kökenleri ve lokalizasyonlarında önemli heterojenliğe sahip hücresel popülasyonlardan oluşur. Esas olarak fetal monositlerden köken alan yerleşik alveoler makrofajlar (AM’ler) alveoler lümende1 bulunurken, kemik iliği kaynaklı interstisyel makrofajlar (IM’ler) akciğer parankiminde bulunur2. IM’ler CD206 ifadesiyle daha da alt sınıflara ayrılabilir. CD206+ IM’ler peribronşiyal ve perivasküler bölgeyi doldururken, CD206– IM’ler alveoler interstisyumda3 bulunur. Son zamanlarda IM’lerin birkaç alt sınıflandırması önerilmiştir3,4,5,6. IM’ler AM’lerden daha az çalışılmasına rağmen, son kanıtlar akciğerin bağışıklık sisteminin düzenlenmesindeki önemli rollerini desteklemektedir7. Ek olarak, CD206 alternatif olarak aktive edilmiş AMs8 ile de ifade edilir.
Pulmoner dendritik hücreler (DC’ler), fonksiyonel özellikleri, yerleri ve kökenleri bakımından akciğer immün hücrelerinin bir başka heterojen grubudur. Akciğerde DC’lerin dört alt kategorisi tanımlanmıştır: geleneksel CD103 + DC’ler (cDC1 olarak da bilinir), geleneksel CD11b + DC’ler (cDC2 olarak da bilinir), monosit kaynaklı DC’ler (MoDC’ler) ve plazmasitoid DC’ler9,10,11,12,13. İlk üç alt sınıf majör histouyumluluk kompleksi (MHC) II+CD11c+9,10,14,15 olarak tanımlanabilir. Plazmasitoid DC’ler MHC II’yi eksprese eder ve CD11c için orta derecede pozitiftir, ancak yüksek B220 ve PDCA-19,13,16 seviyelerini eksprese eder. Naif murin akciğerlerinde, CD103 DC’ler ve CD11b DC’ler hava yolu interstisyumunda bulunurken, plazmasitoid DC’ler alveoler interstisyumda bulunur17.
İki ana monosit popülasyonu, kararlı durum sırasında akciğerde bulunur: klasik monositler ve klasik olmayan monositler. Klasik monositler Ly6C + ‘dır ve başlangıçtaki enflamatuar yanıt için kritiktir. Buna karşılık, klasik olmayan monositler Ly6C’dir ve yaygın olarak anti-enflamatuar hücreler olarak görülmüştür3,16,18. Son zamanlarda, Ly6C– monositlerinden kaynaklanan ve CD206 + IMs3’e yol açan CD64 + CD16.2 + monositlerin ek bir popülasyonu tanımlanmıştır.
Eozinofiller esas olarak helmint enfeksiyonu veya alerjik durumlar sırasında akciğerlerde görülür. Bununla birlikte, yerleşik eozinofiller olarak bilinen, kararlı durum sırasında pulmoner parankimde az sayıda eozinofil vardır. Yerleşik eozinofillerin aksine, akciğer interstisyumunda ve bronkoalveoler lavajda (BAL) inflamatuar eozinofiller bulunur. Ev tozu akarı (HDM) fare modellerinde, enflamatuar eozinofiller, antijen aracılı stimülasyondan sonra akciğere alınır. Yerleşik eozinofillerin, HDM19’a T helper 2 (Th2) duyarlılığını inhibe ederek alerjide düzenleyici bir role sahip olabileceği öne sürülmüştür.
Pulmoner miyeloid hücrelerin geri kalanının aksine, nötrofiller CD68’i değil Ly6G’yi eksprese eder ve CD68-Ly6G + immünofenotip16,20,21’in bir imzası ile karakterize edilir. Görselleştirme çalışmaları, kararlı durum sırasında akciğerin intravasküler kompartmanda bir nötrofil havuzu ayırdığını ve önemli sayıda ekstravasküler nötrofil barındırdığını göstermiştir22. Eozinofillere benzer şekilde, nötrofiller BAL’da kararlı durumda bulunmaz; Bununla birlikte, LPS meydan okuması, astım veya zatürre gibi çeşitli bağışıklık stimülasyon biçimleri, nötrofilleri alveoler lümene sürer ve BAL21,22,23’te bulunmalarına neden olur.
Akciğerin CD45+ hücrelerinin önemli bir kısmı doğal öldürücü (NK), T hücreleri ve B hücrelerini temsil eder ve çoğu miyeloid belirteç için negatiftir24. Naif farelerin akciğerlerinde, bu üç hücre tipi CD11b ve MHC II18 ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir. Pulmoner CD45+ hücrelerinin yaklaşık %25’i B hücreleridir, oysa NK hücrelerinin yüzdesi akciğerde diğer lenfoid ve lenfoid olmayan dokulardan daha yüksektir24,25,26. Pulmoner T hücreleri arasında önemli bir kısmı CD4-CD8– dir ve solunum yolu enfeksiyonlarında önemli bir rol oynar26.
Akciğer, çok karmaşık ve benzersiz bir bağışıklık sistemine ev sahipliği yaptığı için, akciğer bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için çeşitli geçit stratejileri geliştirilmiş ve bildirilmiştir16,18,20,27. Burada açıklanan geçit stratejisi, 9 belirteç kullanarak 12 farklı pulmoner miyeloid ve miyeloid olmayan immün popülasyonu tanımlamak için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Sonuçları doğrulamak için ek belirteçler kullanılmıştır. Ayrıca, hücre ölümünü en aza indiren ve akciğerin bağışıklık hücresi bölmesinin en eksiksiz profilinin belirlenmesini sağlayan tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır. Epitel hücreleri (CD45-CD326+CD31-), endotel hücreleri (CD45-CD326-CD31+) ve fibroblastlar gibi akciğerin immün olmayan hücrelerinin tanımlanmasının farklı bir yaklaşım gerektirdiği unutulmamalıdır28,29. Bu tür popülasyonların tanımlanması, burada açıklanan protokol ve yönteme dahil değildir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pulmoner immün hücrelerin tanımlanması, akciğerde bulunan çoklu immün hücre tipleri ve diğer dokularda bulunan muadillerine kıyasla benzersiz immünofenotipik özellikleri nedeniyle zor olabilir. Çeşitli patolojik durumlarda, akciğerlerde farklı fenotipik özelliklere sahip hücreler ortaya çıkar. Örneğin, bleomisin kaynaklı akciğer hasarı, alveolar boşlukta dolaşımdaki monosit kaynaklı makrofajların işe alınmasıyla sonuçlanır, burada bir yıl kadar kalabilirler ve hatta bleomisin kaynaklı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibeleri R01CA238263 ve R01CA229784 (VAB) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
