Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima ^pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206⁺ pueblan el área peribronquial y perivascular, mientras que los IM CD206^– se encuentran en el intersticio alveolar3. Recientemente se han propuesto algunas subclasificaciones de IM3,4,5,6. Aunque los IM están menos estudiados que los AM, la evidencia reciente apoya su papel crucial en la regulación del sistema inmune del ^pulmón7. Además, CD206 también se expresa en AMs8 activado alternativamente.

Las células dendríticas pulmonares (CD) son otro grupo heterogéneo de células inmunes pulmonares con respecto a sus propiedades funcionales, ubicación y origen. Se han descrito cuatro subcategorías de DC en el pulmón: DC CD103⁺ convencionales (también conocidos como cDC1), CD CD11b⁺ convencionales (también conocidos como cDC2), DC derivados de monocitos (MoDC) y DC plasmocitoides9,10,11,12,13. Las tres primeras subclases se pueden definir como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Los DC plasmocitoides expresan MHC II y son intermediamente positivos para CD11c, pero expresan altos niveles de B220 y PDCA-19,13,16. En los pulmones murinos naïve, los CD CD103 y cd11b se localizan en el intersticio de las vías respiratorias, mientras que los CD plasmocitoides se localizan en el intersticio ^alveolar17.

Dos poblaciones principales de monocitos residen en el pulmón durante el estado estacionario: monocitos clásicos y monocitos no clásicos. Los monocitos clásicos son Ly6C⁺ y son críticos para la respuesta inflamatoria inicial. Por el contrario, los monocitos no clásicos son Ly6C^– y han sido ampliamente vistos como células antiinflamatorias3,16,18. Recientemente, se describió una población adicional de monocitos CD64⁺CD16.2⁺, que se originan a partir de monocitos Ly6C^– y dan lugar a IM CD206⁺³.

Los eosinófilos aparecen principalmente en los pulmones durante la infección por helmintos o afecciones alérgicas. Sin embargo, hay un pequeño número de eosinófilos en el parénquima pulmonar durante el estado estacionario, conocidos como eosinófilos residentes. A diferencia de los eosinófilos residentes, los eosinófilos inflamatorios se encuentran en el intersticio pulmonar y el lavado broncoalveolar (BAL). En modelos de ratón de ácaros del polvo doméstico (HDM), los eosinófilos inflamatorios se reclutan en el pulmón después de la estimulación mediada por antígenos. Se ha propuesto que los eosinófilos residentes podrían tener un papel regulador en la alergia al inhibir la sensibilización del T helper 2 (Th2) a ^HDM19.

A diferencia del resto de células mieloides pulmonares, los neutrófilos expresan Ly6G pero no CD68 y se caracterizan por una firma del inmunofenotipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Los estudios de visualización han demostrado que durante el estado estacionario, el pulmón reserva un grupo de neutrófilos en el compartimento intravascular y alberga un número considerable de neutrófilos ^{extravasculares22}. Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos no se encuentran en BAL en estado estacionario; sin embargo, varias formas de estimulación inmune, como el desafío LPS, el asma o la neumonía, conducen a los neutrófilos a la luz alveolar, lo que resulta en su presencia en BAL21,22,23.

Un número sustancial de células CD45⁺ del pulmón representan un asesino natural (NK), células T y células B y son negativas para la mayoría de los marcadores ^mieloides24. En los pulmones de ratones ingenuos, estos tres tipos de células se pueden identificar en función de la expresión de CD11b y MHC ^II18. Alrededor del 25% de las células CD45⁺ pulmonares son células B, mientras que el porcentaje de células NK es mayor en el pulmón que en otros tejidos linfoides y no linfoides24,25,26. Entre las células T pulmonares, una fracción considerable es ^CD4-CD8– y juega un papel importante en las infecciones ^{respiratorias26}.

Debido a que el pulmón alberga un sistema inmune muy complejo y único, se han desarrollado y reportado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares16,18,20,27. La estrategia de cierre descrita en este documento proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones diferentes de inmunitarias mieloides pulmonares y no mieloides utilizando 9 marcadores. Se han utilizado marcadores adicionales para validar los resultados. Además, se proporciona un método detallado para la preparación de una suspensión unicelular que minimiza la muerte celular y permite la identificación del perfil más completo del compartimiento de células inmunes del pulmón. Cabe destacar que la identificación de células no inmunes del pulmón, como las células epiteliales (CD45-CD326⁺CD31^–), las células endoteliales (CD45-CD326-CD31⁺) y los fibroblastos requiere un abordaje ^{diferente28,29}. La identificación de tales poblaciones no está incluida en el protocolo y método descritos aquí.