Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

Il tratto respiratorio murino contiene un sistema immunitario unico responsabile della lotta contro gli agenti patogeni e del mantenimento dell’omeostasi immunitaria. Il sistema immunitario polmonare è costituito da popolazioni cellulari con significativa eterogeneità nel loro fenotipo, funzione, origine e posizione. I macrofagi alveolari residenti (AM), originati principalmente da monociti fetali, risiedono nel lume alveolare1, mentre i macrofagi interstiziali derivati dal midollo osseo (IM) risiedono nel parenchima ^polmonare2. I MESSAGGI possono essere ulteriormente sottoclassificati dall’espressione di CD206. I DM CD206⁺ popolano l’area peribronchiale e perivascolare, mentre i DM CD206^– si trovano all’interstizio alveolare3. Recentemente sono state proposte alcune sottoclassificazioni di IM3,4,5,6. Sebbene gli IM siano meno studiati degli AM, prove recenti supportano il loro ruolo cruciale nella regolazione del sistema immunitario del ^polmone7. Inoltre, CD206 è espresso anche in ^AM8 attivati alternativamente.

Le cellule dendritiche polmonari (DC) sono un altro gruppo eterogeneo di cellule immunitarie polmonari per quanto riguarda le loro proprietà funzionali, posizione e origine. Quattro sottocategorie di DC sono state descritte nel polmone: DC CD103⁺ convenzionali (note anche come cDC1), DC CD11b⁺ convenzionali (note anche come cDC2), DC derivate da monociti (MoDC) e DC plasmacitoidi9,10,11,12,13. Le prime tre sottoclassi possono essere definite come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. I DC plasmacitoidi esprimono MHC II e sono intermediamente positivi per CD11c ma esprimono alti livelli di B220 e PDCA-19,13,16. Nei polmoni murini naïve, le DC CD103 e le DC CD11b si trovano nell’interstizio delle vie aeree, mentre le DC plasmacitoidi si trovano nell’interstizio ^alveolare17.

Due principali popolazioni di monociti risiedono nel polmone durante lo stato stazionario: monociti classici e monociti non classici. I monociti classici sono Ly6C⁺ e sono fondamentali per la risposta infiammatoria iniziale. Al contrario, i monociti non classici sono Ly6C^– e sono stati ampiamente visti come cellule antinfiammatorie3,16,18. Recentemente, è stata descritta un’ulteriore popolazione ^{di monociti} CD64⁺CD16.2+, che provengono da monociti Ly6C^– e danno origine a CD206^{+ IM3}.

Gli eosinofili compaiono principalmente nei polmoni durante l’infezione da elminti o condizioni allergiche. Tuttavia, c’è un piccolo numero di eosinofili nel parenchima polmonare durante lo stato stazionario, noto come eosinofili residenti. In contrasto con gli eosinofili residenti, gli eosinofili infiammatori si trovano nell’interstizio polmonare e nel lavaggio broncoalveolare (BAL). Nei modelli murini di acaro della polvere domestica (HDM), gli eosinofili infiammatori vengono reclutati nel polmone dopo la stimolazione mediata dall’antigene. È stato proposto che gli eosinofili residenti potrebbero avere un ruolo regolatore nell’allergia inibendo la sensibilizzazione T helper 2 (Th2) a ^HDM19.

A differenza del resto delle cellule mieloidi polmonari, i neutrofili esprimono Ly6G ma non CD68 e sono caratterizzati da una firma dell’immunofenotipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Studi di visualizzazione hanno dimostrato che durante lo stato stazionario, il polmone riserva un pool di neutrofili nel compartimento intravascolare e ospita un numero considerevole di neutrofili ^{extravascolari22}. Simile agli eosinofili, i neutrofili non si trovano in BAL allo stato stazionario; tuttavia, diverse forme di stimolazione immunitaria, come la sfida LPS, l’asma o la polmonite, spingono i neutrofili nel lume alveolare, con conseguente presenza in BAL21,22,23.

Un numero considerevole di cellule CD45⁺ del polmone rappresentano cellule natural killer (NK), T e B e sono negative per la maggior parte dei marcatori mieloidi24. Nei polmoni di topi naïve, questi tre tipi di cellule possono essere identificati in base all’espressione di CD11b e MHC ^II18. Circa il 25% delle cellule CD45⁺ polmonari sono cellule B, mentre la percentuale di cellule NK è più alta nel polmone rispetto ad altri tessuti linfoidi e non linfoidi24,25,26. Tra le cellule T polmonari, una frazione considerevole è ^CD4-CD8– e svolge un ruolo importante nelle infezioni ^{respiratorie26}.

Poiché il polmone ospita un sistema immunitario molto complesso e unico, sono state sviluppate e riportate diverse strategie di gating per l’identificazione delle cellule immunitarie polmonari16,18,20,27. La strategia di gating qui descritta fornisce un modo completo e riproducibile per identificare fino a 12 diverse popolazioni immunitarie mieloidi polmonari e non mieloidi utilizzando 9 marcatori. Ulteriori marcatori sono stati utilizzati per convalidare i risultati. Inoltre, viene fornito un metodo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare che minimizza la morte cellulare e consente l’identificazione del profilo più completo del compartimento cellulare immunitario del polmone. Va notato che l’identificazione delle cellule non immunitarie del polmone, come le cellule epiteliali (CD45-CD326⁺CD31^–), le cellule endoteliali (CD45-CD326-CD31⁺) e i fibroblasti richiede un approccio ^diverso28,29. L’identificazione di tali popolazioni non è inclusa nel protocollo e nel metodo qui descritti.