Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme ^pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent être subclassés par l’expression CD206. Les IM CD206⁺ peuplent la région péribronchique et périvasculaire, tandis que les IM CD206^– sont situés à l’interstitium alvéolaire3. Quelques sous-classifications des GI ont été proposées récemment3,4,5,6. Bien que les MI soient moins étudiées que les AM, des preuves récentes soutiennent leur rôle crucial dans la régulation du système immunitaire du ^poumon7. En outre, CD206 est également exprimé dans AMs8 activé alternativement.

Les cellules dendritiques pulmonaires (DC) sont un autre groupe hétérogène de cellules immunitaires pulmonaires en ce qui concerne leurs propriétés fonctionnelles, leur emplacement et leur origine. Quatre sous-catégories de DC ont été décrites dans les poumons : les DC CD103⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC1), les DC CD11b⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC2), les DC dérivés de monocytes (MoDC) et les DC plasmocytoïdes9,10,11,12,13. Les trois premières sous-classes peuvent être définies comme complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Les DC plasmocytoïdes expriment le CMH II et sont moyennement positifs pour cd11c, mais expriment des niveaux élevés de B220 et de PDCA-19,13,16. Dans les poumons murins naïfs, les DC CD103 et CD11b sont situés dans l’interstitium des voies respiratoires, tandis que les DC plasmocytoïdes sont situés dans l’interstitium ^{alvéolaire17}.

Deux grandes populations de monocytes résident dans le poumon pendant l’état d’équilibre: les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Les monocytes classiques sont Ly6C⁺ et sont essentiels pour la réponse inflammatoire initiale. En revanche, les monocytes non classiques sont Ly6C^– et ont été largement considérés comme des cellules anti-inflammatoires3,16,18. Récemment, une population supplémentaire de monocytes CD64⁺CD16.2⁺ a été décrite, qui proviennent de monocytes Ly6C^– et donnent naissance à CD206⁺ IMs3.

Les éosinophiles apparaissent principalement dans les poumons lors d’une infection à helminthes ou de conditions allergiques. Cependant, il y a un petit nombre d’éosinophiles dans le parenchyme pulmonaire pendant l’état d’équilibre, connus sous le nom d’éosinophiles résidents. Contrairement aux éosinophiles résidents, les éosinophiles inflammatoires se trouvent dans l’interstitium pulmonaire et le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les modèles murins d’acariens de la poussière domestique (HDM), les éosinophiles inflammatoires sont recrutés dans les poumons après une stimulation médiée par l’antigène. Il a été proposé que les éosinophiles résidents pourraient avoir un rôle régulateur dans l’allergie en inhibant la sensibilisation de T helper 2 (Th2) à ^HDM19.

Contrairement au reste des cellules myéloïdes pulmonaires, les neutrophiles expriment Ly6G mais pas CD68 et sont caractérisés par une signature de l’immunophénotype CD68-Ly6G⁺16,20,21. Des études de visualisation ont montré qu’à l’état d’équilibre, le poumon réserve un pool de neutrophiles dans le compartiment intravasculaire et héberge un nombre considérable de neutrophiles extravasculaires22. Semblable aux éosinophiles, les neutrophiles ne se trouvent pas dans BAL à l’état d’équilibre; cependant, plusieurs formes de stimulation immunitaire, telles que le défi LPS, l’asthme ou la pneumonie, conduisent les neutrophiles dans la lumière alvéolaire, ce qui entraîne leur présence dans BAL21,22,23.

Un nombre important de cellules CD45⁺ du poumon représentent un tueur naturel (NK), des cellules T et des cellules B et sont négatives pour la plupart des marqueurs myéloïdes24. Dans les poumons de souris naïves, ces trois types de cellules peuvent être identifiés sur la base de l’expression de CD11b et de CMH ^II18. Environ 25% des cellules PULMONAIREs CD45^{+ sont des} cellules B, tandis que le pourcentage de cellules NK est plus élevé dans les poumons que les autres tissus lymphoïdes et non lymphoïdes24,25,26. Parmi les lymphocytes T pulmonaires, une fraction considérable est ^CD4-CD8– et joue un rôle important dans les infections ^{respiratoires26}.

Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées16,18,20,27. La stratégie de contrôle décrite ici fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de 9 marqueurs. Des marqueurs supplémentaires ont été utilisés pour valider les résultats. En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification du profil le plus complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Il convient de noter que l’identification des cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326⁺CD31^–), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31⁺) et les fibroblastes nécessite une approche ^{différente28,29}. L’identification de ces populations n’est pas incluse dans le protocole et la méthode décrits ici.