Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

De muizenweg bevat een uniek immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor het bestrijden van ziekteverwekkers en het handhaven van immuunhomeostase. Het pulmonale immuunsysteem bestaat uit cellulaire populaties met een significante heterogeniteit in hun fenotype, functie, oorsprong en locatie. Residente alveolaire macrofagen (AM’s), voornamelijk afkomstig van foetale monocyten, bevinden zich in het alveolaire ^lumen1, terwijl van beenmerg afgeleide interstitiële macrofagen (IM’s) zich in het longparenchym ^bevinden2. IM’s kunnen verder worden gesubclassificeerd door de expressie van CD206. CD206⁺ IM’s bevolken het peribronchiale en perivasculaire gebied, terwijl CD206-IM’s zich bevinden op het alveolaire interstitium3. Onlangs zijn enkele subclassificaties van im’s voorgesteld3,4,5,6. Hoewel IM’s minder worden bestudeerd dan AM’s, ondersteunt recent bewijs hun cruciale rol in de regulatie van het immuunsysteem van de ^long7. Daarnaast wordt CD206 ook uitgedrukt in alternatief geactiveerde ^AMs8.

Pulmonale dendritische cellen (DC’s) zijn een andere heterogene groep longimmuuncellen met betrekking tot hun functionele eigenschappen, locatie en oorsprong. Vier subcategorieën van DC’s zijn beschreven in de longen: conventionele CD103 ⁺ DC’s (ook bekend als cDC1), conventionele CD11b ⁺ DC’s (ook bekend als cDC2), monocyt-afgeleide DC’s (MoDC’s) en plasmacytoïde DC’s9,10,11,12,13. De eerste drie subklassen kunnen worden gedefinieerd als major histocompatibility complex (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Plasmacytoïde DC’s drukken MHC II uit en zijn gemiddeld positief voor CD11c, maar drukken hoge niveaus van B220 en PDCA-19,13,16 uit. In naïeve muizenlongen bevinden CD103 DC’s en CD11b DC’s zich in het luchtweginterstitium, terwijl plasmacytoïde DC’s zich in het alveolaire ^{interstitium17} bevinden.

Twee belangrijke populaties van monocyten verblijven in de longen tijdens steady state: klassieke monocyten en niet-klassieke monocyten. Klassieke monocyten zijn Ly6C⁺ en zijn van cruciaal belang voor de initiële ontstekingsreactie. Daarentegen zijn niet-klassieke monocyten Ly6C^– en worden ze algemeen beschouwd als ontstekingsremmende cellen3,16,18. Onlangs werd een extra populatie cd64⁺cd16,2⁺ monocyten beschreven, die afkomstig zijn van Ly6C-monocyten en aanleiding geven tot CD206⁺ IM’s3.

Eosinofielen verschijnen voornamelijk in de longen tijdens worminfectie of allergische aandoeningen. Er is echter een klein aantal eosinofielen in het pulmonale parenchym tijdens steady state, bekend als resident eosinofielen. In tegenstelling tot de resident eosinofielen worden inflammatoire eosinofielen gevonden in het longinterstitium en bronchoalveolaire lavage (BAL). In muismodellen van huisstofmijt (HDM) worden inflammatoire eosinofielen in de longen gerekruteerd na antigeen-gemedieerde stimulatie. Er is voorgesteld dat resident eosinofielen een regulerende rol kunnen spelen bij allergie door T-helper 2 (Th2) sensibilisatie voor ^HDM19 te remmen.

In tegenstelling tot de rest van de myeloïde longcellen, drukken neutrofielen Ly6G uit, maar niet CD68 en worden gekenmerkt door een signatuur van het CD68-Ly6G⁺ immunofenotype16,20,21. Visualisatiestudies hebben aangetoond dat tijdens steady state de longen een pool van neutrofielen in het intravasculaire compartiment reserves en een aanzienlijk aantal extravasculaire neutrofielen ^host22. Net als eosinofielen worden neutrofielen niet gevonden in BAL bij steady state; verschillende vormen van immuunstimulatie, zoals LPS-uitdaging, astma of longontsteking, drijven neutrofielen echter in het alveolaire lumen, wat resulteert in hun aanwezigheid in BAL21,22,23.

Een aanzienlijk aantal CD45⁺ cellen van de long vertegenwoordigen natural killer (NK), T-cellen en B-cellen en zijn negatief voor de meeste myeloïde ^markers24. In de longen van naïeve muizen kunnen deze drie celtypen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van CD11b en MHC ^II18. Ongeveer 25% van de pulmonale CD45⁺ cellen zijn B-cellen, terwijl het percentage NK-cellen hoger is in de longen dan andere lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels24,25,26. Onder pulmonale T-cellen is een aanzienlijk deel ^CD4-CD8– en speelt een belangrijke rol bij luchtweginfecties26.

Omdat de long een zeer complex en uniek immuunsysteem herbergt, zijn verschillende gatingstrategieën voor de identificatie van longimmuuncellen ontwikkeld en gerapporteerd16,18,20,27. De hierin beschreven gating-strategie biedt een uitgebreide en reproduceerbare manier om tot 12 verschillende pulmonale myeloïde en niet-myeloïde immuunpopulaties te identificeren met behulp van 9 markers. Extra markers zijn gebruikt om de resultaten te valideren. Bovendien wordt een gedetailleerde methode geboden voor de bereiding van een eencellige suspensie die celdood minimaliseert en de identificatie van het meest complete profiel van het immuuncelcompartiment van de long mogelijk maakt. Opgemerkt moet worden dat de identificatie van niet-immuuncellen van de long, zoals epitheelcellen (CD45-CD326 ⁺ CD31^–), endotheelcellen (CD45-CD326-CD31 ⁺), en fibroblasten een andere aanpak ^vereist28,29. Identificatie van dergelijke populaties is niet opgenomen in het protocol en de methode die hier worden beschreven.