הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

מדעי “Omics” מאופיינים בניתוח עמוק של ערכת מולקולות, כגון DNA, RNA, חלבונים, פפטידים, מטבוליטים וכו ‘. ערכות נתונים בקנה מידה גדול אלה (גנומיקה, תמלול, פרוטאומיה, פפטידומיקה, מטבולומיה וכו ‘) חוללו מהפכה בביולוגיה והובילו להבנה מתקדמת של תהליכים ^{ביולוגיים1}. המונח פפטידומיקה החל להיות מוצג בתחילת ^{המאה ה –}20, וכמה מחברים התייחסו אליו כענף של פרוטאומיקס2. עם זאת, לפפטידוזיקה יש פרטים ברורים, כאשר האינטרס העיקרי הוא לחקור את תוכן הפפטידים שנוצר באופן טבעי במהלך תהליכים תאיים, כמו גם את אפיון הפעילות הביולוגית של מולקולות ^אלה3,4.

בתחילה, מחקרי פפטיד ביואקטיביים הוגבלו נוירופפטידים ופפטידים הורמונליים באמצעות השפלה אדמן ורדיוימונואסאי. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות ניתוח גלובלי, בהתאם לבידוד של כל פפטיד בריכוזים גבוהים, זמן ליצירת נוגדנים, מלבד אפשרות תגובה ^צולבת5.

ניתוח פפטידומיקה התאפשר רק לאחר מספר התקדמות בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS) ופרויקטים של גנום שסיפקו מאגרי נתונים מקיפים למחקרי פרוטאומיקה/פפטידומיקה6,7. יתר על כן, פרוטוקול מיצוי פפטיד ספציפי עבור peptidomes היה צריך להיות הוקם כי המחקרים הראשונים שניתחו neuropeptides ברחבי העולם בדגימות המוח הראו כי זיהוי הושפע השפלה מסיבית של חלבונים, אשר מתרחשים בעיקר ברקמה זו לאחר 1 דקות לאחר המוות. נוכחותם של שברי פפטיד אלה הסתירו את אות הנוירופפטיד ולא ייצגו את הפפטידום ב- vivo. בעיה זו נפתרה בעיקר עם היישום של חימום מהיר של פעילות פרוטאזים באמצעות הקרנת מיקרוגל, אשר הפחית באופן דרסטי את נוכחותם של שברי חפץ אלה ואפשר לא רק זיהוי של שברי נוירופפטיד, אלא חשף את נוכחותם של קבוצה של פפטידים מחלבונים ציטוזוליים, מיטוכונדריאליים וגרעין, שונים של degradome6,8,9.

הליכים מתודולוגיים אלה אפשרו הרחבה של הפפטידום מעבר לנוירופפטידים הידועים, שם זוהו מאות פפטידים תאיים שנוצרו בעיקר על ידי פעולת הפרוטאוזומים ^{בשמרים10}, ^זברה11, רקמות מכרסמים12 ותאים ^{אנושיים13}. עשרות פפטידים תאיים אלה הוכחו בהרחבה כבעלי פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגיות ^{כאחד14,15}. יתר על כן, פפטידים אלה יכולים לשמש סמנים ביולוגיים של מחלות ואולי יש משמעות קלינית, כפי שהוכח בנוזל השדרתי מחולים עם מפרצת תוך ^{גולגולתית16}.

נכון לעכשיו, בנוסף לזיהוי רצפי פפטיד, ניתן באמצעות ספקטרומטריית מסה להשיג נתונים של כמות מוחלטת ויחסית. בכמות המוחלטת, רמות הפפטיד במדגם ביולוגי מושוות לתקנים סינתטיים, ואילו בכמות היחסית, רמות הפפטיד משווות בין שתי דגימות או ^יותר17. כמות יחסית יכולה להתבצע באמצעות הגישות הבאות: 1) “תווית חינם”¹⁸; 2) בסימון מטבולי vivo או 3) תיוג כימי. שני האחרונים מבוססים על שימוש בצורות איזוטופיות יציבות המשולבות ^{בפפטידים19,20}. בניתוח ללא תוויות, רמות הפפטיד מוערכות על ידי התחשבות בעוצמת האות (ספירות ספקטרליות) במהלך ^LC-MS18. עם זאת, תיוג איזוטופי יכול להשיג רמות יחסיות מדויקות יותר של פפטידים.

מחקרים פפטידום רבים השתמשו טרימתילאמוניום butyrate (TMAB) תיוג ריאגנטים כמו תיוג כימי, ולאחרונה, מתילציה רדוקטיבית של אמינים (RMA) עם צורות deuteed ולא deuteed של פורמלדהיד ונתרן cyanoborohydride ריאגנטים שימשו11,21,222. עם זאת, תוויות TMAB אינן זמינות מסחרית, ותהליך הסינתזה הוא מייגע מאוד. מצד שני, ב RMA, ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה תוויות אחרות, ההליך הוא פשוט לביצוע, ואת פפטידים מסומנים ^{יציבים23,24}.

השימוש ב- RMA כרוך בהקמת בסיס שיף על ידי מתן אפשרות לפפטידים להגיב עם פורמלדהיד, ואחריו תגובת הפחתה באמצעות ציאנובורוהידריד. תגובה זו גורמת דימתילציה של קבוצות אמינו חינם על N-מסופים ושרשראות צד ליצין ו monomethylates N-מסוף prolines. איך שאריות פרולין הם לעתים קרובות נדיר על N-מסוף, כמעט כל הפפטידים עם אמינים חינם על N-טרמינל מסומנים עם שתי קבוצות מתיל23,24,25^.