Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

“Omics” -Wissenschaften zeichnen sich durch die tiefe Analyse eines Molekülsatzes wie DNA, RNA, Proteine, Peptide, Metaboliten usw. aus. Diese generierten groß angelegten Datensätze (Genomik, Transkriptomik, Proteomik, Peptidomik, Metabolomik usw.) haben die Biologie revolutioniert und zu einem fortgeschrittenen Verständnis biologischer Prozesse ^geführt1. Der Begriff Peptidomik wurde im frühen 20^. Jahrhundert eingeführt, und einige Autoren haben ihn als einen Zweig der Proteomik ^bezeichnet2. Die Peptidomik weist jedoch deutliche Besonderheiten auf, wobei das Hauptinteresse darin besteht, den natürlich erzeugten Peptidgehalt während zellulärer Prozesse sowie die Charakterisierung der biologischen Aktivität dieser Moleküle zu ^{untersuchen3,4}.

Zunächst beschränkten sich bioaktive Peptidstudien auf die Neuropeptide und Hormonpeptide durch Edman-Abbau und Radioimmunoassay. Diese Techniken erlauben jedoch keine globale Analyse, abhängig von der Isolierung jedes Peptids in hohen Konzentrationen, Zeit für die Bildung von Antikörpern, neben der Kreuzreaktivitätsmöglichkeit5.

Die Peptidomik-Analyse wurde erst nach mehreren Fortschritten in der Flüssigkeitschromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie (LC-MS) und Genomprojekten ermöglicht, die umfassende Datenpools für Proteomik-/Peptidomik-Studien ^lieferten6,7. Darüber hinaus musste ein spezifisches Peptidextraktionsprotokoll für Peptidome etabliert werden, da die ersten Studien, die Neuropeptide weltweit in Gehirnproben analysierten, zeigten, dass der Nachweis durch den massiven Abbau von Proteinen beeinflusst wurde, die hauptsächlich in diesem Gewebe nach 1 min Post mortem auftreten. Das Vorhandensein dieser Peptidfragmente maskierte das Neuropeptidsignal und stellte das Peptidom in vivo nicht dar. Dieses Problem wurde hauptsächlich durch die Anwendung der schnellen Erwärmungsinaktivierung von Proteasen mittels Mikrowellenbestrahlung gelöst, die das Vorhandensein dieser Artefaktfragmente drastisch reduzierte und nicht nur die Identifizierung von Neuropeptidfragmenten ermöglichte, sondern auch das Vorhandensein einer Reihe von Peptiden aus zytosolischen, mitochondrialen und Kernproteinen aufdeckte, die sich von Degradome ^{unterscheiden6,8,9}.

Diese methodischen Verfahren ermöglichten eine Erweiterung des Peptidoms über die bekannten Neuropeptide hinaus, wo Hunderte von intrazellulären Peptiden, die hauptsächlich durch die Wirkung von Proteasomen erzeugt wurden, in ^Hefe10, ^{Zebrafischen11}, Nagetiergeweben12 und menschlichen ^Zellen13 identifiziert wurden. Dutzende dieser intrazellulären Peptide haben nachweislich sowohl biologische als auch pharmakologische ^{Aktivitäten14,15}. Darüber hinaus können diese Peptide als Krankheitsbiomarker verwendet werden und haben möglicherweise klinische Bedeutung, wie in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit intrakraniellen sackförmigen Aneurysmen gezeigt ^wurde16.

Derzeit ist es neben der Identifizierung von Peptidsequenzen durch Massenspektrometrie möglich, Daten der absoluten und relativen Quantifizierung zu erhalten. Bei der absoluten Quantifizierung werden die Peptidspiegel in einer biologischen Probe mit synthetischen Standards verglichen, während bei der relativen Quantifizierung die Peptidspiegel zwischen zwei oder mehr Proben verglichen ^werden17. Die relative Quantifizierung kann mit den folgenden Ansätzen durchgeführt werden: 1) “label free”¹⁸; 2) in vivo metabolische Markierung oder 3) chemische Markierung. Die letzten beiden basieren auf der Verwendung stabiler Isotopenformen, die in Peptide eingebaut ^sind19,20. Bei der markierungsfreien Analyse werden die Peptidspiegel unter Berücksichtigung der Signalstärke (Spektralzählungen) während des ^LC-MS18 geschätzt. Die Isotopenmarkierung kann jedoch genauere relative Konzentrationen von Peptiden erhalten.

Viele peptidomische Studien verwendeten Trimethylammoniumbutyrat (TMAB) Markierungsreagenzien als chemische Markierung, und in jüngerer Zeit wurde die reduktive Methylierung von Aminen (RMA) mit deuterierten und nicht deuterierten Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydridreagenzien verwendet11,21,22. Die TMAB-Etiketten sind jedoch nicht im Handel erhältlich und der Syntheseprozess ist sehr aufwendig. Auf der anderen Seite sind die Reagenzien in der RMA kommerziell erhältlich, kostengünstig im Vergleich zu anderen Etiketten, das Verfahren ist einfach durchzuführen und die markierten Peptide sind ^stabil23,24.

Die Verwendung von RMA beinhaltet die Bildung einer Schiff-Base, indem die Peptide mit Formaldehyd reagieren können, gefolgt von einer Reduktionsreaktion durch das Cyanoborhydrid. Diese Reaktion bewirkt eine Dimethylierung freier Aminogruppen auf N-terminalen und Lysin-Seitenketten und Monomethylaten N-terminalen Prolinen. Da Prolinreste auf dem N-Terminal oft selten sind, sind praktisch alle Peptide mit freien Aminen am N-Terminus mit zwei Methylgruppen markiert23,24,25^.