Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

“Omics” wetenschappen worden gekenmerkt door de diepe analyse van een molecuulset, zoals DNA, RNA, eiwitten, peptiden, metabolieten, enz. Deze gegenereerde grootschalige datasets (genomics, transcriptomics, proteomics, peptidomics, metabolomics, etc.) hebben een revolutie teweeggebracht in de biologie en geleid tot een geavanceerd begrip van biologische ^processen1. De term peptidomics begon te worden geïntroduceerd in het begin van de ^20e eeuw, en sommige auteurs hebben ernaar verwezen als een tak van proteomics2. Peptidomics heeft echter verschillende bijzonderheden, waarbij het belangrijkste belang is om het natuurlijk gegenereerde peptidengehalte tijdens cellulaire processen te onderzoeken, evenals de karakterisering van biologische activiteit van deze ^moleculen3,4.

Aanvankelijk waren bioactieve peptidestudies beperkt tot de neuropeptiden en hormoonpeptiden door Edman-afbraak en radioimmunoassay. Deze technieken laten echter geen globale analyse toe, afhankelijk van de isolatie van elk peptide in hoge concentraties, tijd voor het genereren van antilichamen, naast kruisreactiviteitsmogelijkheid5.

Peptidomics-analyse werd pas mogelijk gemaakt na verschillende ontwikkelingen in vloeistofchromatografie gekoppelde massaspectrometrie (LC-MS) en genoomprojecten die uitgebreide datapools opleverden voor proteomics/peptidomics ^studies6,7. Bovendien moest een specifiek peptide-extractieprotocol voor peptidomes worden vastgesteld omdat de eerste studies die neuropeptiden wereldwijd in hersenmonsters analyseerden, aantoonden dat detectie werd beïnvloed door de massale afbraak van eiwitten, die voornamelijk in dit weefsel voorkomen na 1 minuut post-mortem. De aanwezigheid van deze peptidefragmenten maskeerde het neuropeptidesignaal en vertegenwoordigde niet de peptidome in vivo. Dit probleem werd voornamelijk opgelost met de toepassing van snelle verwarmingsinactivatie van proteasen met behulp van microgolfbestraling, die de aanwezigheid van deze artefactfragmenten drastisch verminderde en niet alleen de identificatie van neuropeptidefragmenten mogelijk maakte, maar ook de aanwezigheid van een reeks peptiden uit cytosolische, mitochondriale en nucleaire eiwitten onthulde, verschillend van degradome6,8,9.

Deze methodologische procedures maakten een uitbreiding van de peptidome mogelijk voorbij de bekende neuropeptiden, waar honderden intracellulaire peptiden die voornamelijk worden gegenereerd door de werking van proteasooms zijn geïdentificeerd in ^gist10, ^zebravis11, knaagdierweefsels12 en menselijke ^cellen13. Van tientallen van deze intracellulaire peptiden is uitgebreid aangetoond dat ze zowel biologische als farmacologische activiteiten ^hebben14,15. Bovendien kunnen deze peptiden worden gebruikt als ziektebiomarkers en hebben ze mogelijk klinische betekenis, zoals aangetoond in hersenvocht van patiënten met intracraniale sacculaire aneurysmata16.

Momenteel is het, naast de identificatie van peptidesequenties, mogelijk om door massaspectrometrie gegevens van absolute en relatieve kwantificering te verkrijgen. In de absolute kwantificering worden de peptideniveaus in een biologisch monster vergeleken met synthetische standaarden, terwijl in de relatieve kwantificering de peptideniveaus worden vergeleken tussen twee of meer ^monsters17. Relatieve kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van de volgende benaderingen: 1) “labelvrij”¹⁸; 2) in vivo metabole etikettering of 3) chemische etikettering. De laatste twee zijn gebaseerd op het gebruik van stabiele isotopische vormen die zijn opgenomen in ^{peptiden19,20}. In labelvrije analyse worden de peptideniveaus geschat door rekening te houden met de signaalsterkte (spectrale tellingen) tijdens de ^LC-MS18. Isotopische etikettering kan echter nauwkeurigere relatieve niveaus van peptiden verkrijgen.

Veel peptidomische studies gebruikten trimethylammoniumbutyraat (TMAB) etiketteringsreagentia als chemische etikettering, en meer recent zijn reductieve methylatie van amines (RMA) met gedeutereerde en niet-gedeutereerde vormen van formaldehyde en natriumcyanoborohydridereagentia gebruikt11,21,22. De TMAB-labels zijn echter niet commercieel verkrijgbaar en het syntheseproces is zeer arbeidsintensief. Aan de andere kant zijn de reagentia in de RMA commercieel verkrijgbaar, goedkoop in vergelijking met andere labels, is de procedure eenvoudig uit te voeren en zijn de gelabelde peptiden ^stabiel23,24.

Het gebruik van RMA omvat het vormen van een Schiff-base door de peptiden te laten reageren met formaldehyde, gevolgd door een reductiereactie via het cyanoborohydride. Deze reactie veroorzaakt dimethylering van vrije aminogroepen op N-terminals en lysine zijketens en monomethylaten N-terminale prolines. Hoe prolineresiduen vaak zeldzaam zijn op de N-terminal, vrijwel alle peptiden met vrije amines op de N-terminus zijn gelabeld met twee methylgroepen23,24,25^.