إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي
Summary
توضح هذه المقالة طريقة إعداد عينة تستند إلى تعطيل الحرارة للحفاظ على الببتيدات الذاتية تجنب تدهور بعد الوفاة، تليها الكمية النسبية باستخدام وضع العلامات النظيرية بالإضافة إلى LC-MS.
Abstract
يمكن تعريف Peptidomics على أنه التحليل النوعي والكمي للببتيدات في عينة بيولوجية. وتشمل تطبيقاتها الرئيسية تحديد المؤشرات الحيوية الببتيد للمرض أو الإجهاد البيئي، وتحديد الببتيدات العصبية والهرمونات والببتيدات النشطة بيولوجيا داخل الخلايا، واكتشاف الببتيدات المضادة للميكروبات والنوترية من التحللات المائية البروتينية، ويمكن استخدامها في الدراسات لفهم العمليات البروتيوليكية. وقد ساهم التقدم الأخير في إعداد العينات وطرق الفصل وتقنيات قياس الطيف الكتلي والأدوات الحسابية المتعلقة بتسلسل البروتين في زيادة عدد الببتيدات المحددة والببتيدات المميزة. دراسات الببتيدات في كثير من الأحيان تحليل الببتيدات التي يتم إنشاؤها بشكل طبيعي في الخلايا. هنا ، يتم وصف بروتوكول إعداد العينة على أساس تعطيل الحرارة ، مما يلغي نشاط البروتيز ، والاستخراج مع ظروف خفيفة ، لذلك لا يوجد انشقاق في روابط الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر أيضا الكمية النسبية للببتيدات باستخدام وسم النظائر المستقرة عن طريق الميثيل الاختزالي للأمينات. هذه الطريقة وضع العلامات لديها بعض المزايا والكواشف المتاحة تجاريا، وغير مكلفة بالمقارنة مع غيرها، مستقرة كيميائيا، ويسمح بتحليل ما يصل إلى خمس عينات في تشغيل LC-MS واحد.
Introduction
تتميز علوم “Omics” بالتحليل العميق لمجموعة الجزيئات ، مثل الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتينات ، الببتيدات ، المستقلبات ، إلخ. وقد أحدثت هذه مجموعات البيانات على نطاق واسع (علم الجينوم، وعلم النسخ، والبروتيوميات، وعلم البيبتيدم، وعلم الأيض، وما إلى ذلك) ثورة في علم الأحياء وأدت إلى فهم متقدم للعمليات البيولوجية1. بدأ مصطلح peptidomics في أوائل القرن العشرين ، وقد أشار إليه بعض المؤلفين على أنه فرع من proteomics2. ومع ذلك ، فإن peptidomics له خصائص متميزة ، حيث يكون الاهتمام الرئيسي هو التحقيق في محتوى الببتيدات المتولد بشكل طبيعي أثناء العمليات الخلوية ، وكذلك توصيف النشاط البيولوجي لهذه الجزيئات3،4.
في البداية، اقتصرت دراسات الببتيد النشطة بيولوجيا على الببتيدات العصبية والببتيدات الهرمونية من خلال تدهور إدمان والكيمونواساي الإشعاعي. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تسمح بإجراء تحليل عالمي، اعتمادا على عزل كل الببتيد بتركيزات عالية، والوقت لتوليد الأجسام المضادة، إلى جانب إمكانية التفاعل المتبادل5.
ولم يتسن إجراء تحليل Peptidomics إلا بعد عدة أوجه تقدم في الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS) ومشاريع الجينوم التي قدمت تجمعات بيانات شاملة لدراسات البروتيوميات/علم البيبتيديميكس6،7. وعلاوة على ذلك، كان لا بد من وضع بروتوكول محدد لاستخراج الببتيد للببتيدات لأن الدراسات الأولى التي حللت الببتيدات العصبية على الصعيد العالمي في عينات الدماغ أظهرت أن الكشف تأثر بالتدهور الهائل للبروتينات، التي تحدث أساسا في هذا النسيج بعد دقيقة واحدة بعد الوفاة. وجود هذه شظايا الببتيد يخفي إشارة الببتيد العصبي ولم يمثل الببتيدومي في الجسم الحي. تم حل هذه المشكلة بشكل رئيسي مع تطبيق تعطيل التدفئة السريعة من البروتياز باستخدام إشعاع الميكروويف ، مما قلل بشكل كبير من وجود هذه الأجزاء الأثرية وسمح ليس فقط بتحديد شظايا الببتيد العصبي ولكن كشف عن وجود مجموعة من الببتيدات من البروتينات الخلوية والميتوكوندريا والنووية ، مختلفة عن degradome6،8،9.
سمحت هذه الإجراءات المنهجية بتوسيع الببتيدوم إلى ما وراء الببتيدات العصبية المعروفة ، حيث تم تحديد مئات الببتيدات داخل الخلايا التي تم إنشاؤها بشكل رئيسي من خلال عمل البروتياسومات في yeast10 ، zebrafish11 ، أنسجة القوارض12 ، والخلايا البشرية13. وقد ثبت على نطاق واسع أن العشرات من هذه الببتيدات داخل الخلايا لديها أنشطة بيولوجية ودوائية على حد سواء14,15. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الببتيدات كمؤشرات بيولوجية للمرض وربما يكون لها أهمية سريرية، كما هو موضح في السائل النخاعي من المرضى الذين يعانون من تمدد الأوعية الدموية التراكمي داخل الجمجمة16.
حاليا، بالإضافة إلى تحديد تسلسل الببتيد، فمن الممكن من خلال قياس الطيف الكتلي للحصول على بيانات الكمية المطلقة والنسبية. في الكمية المطلقة ، يتم مقارنة مستويات الببتيد في العينة البيولوجية بالمعايير الاصطناعية ، بينما في الكمية النسبية ، يتم مقارنة مستويات الببتيد بين عينتين أو أكثر17. ويمكن إجراء الكمية النسبية باستخدام النهج التالية: 1) “خالية من التسمية”18؛ (2) “خالية من التسمية”18؛ (2) “3” “3” “3” و”3″ “3” “3” و”1″ “3 2) في الوسم الأيضي في الجسم الحي أو 3) وضع العلامات الكيميائية. ويستند الأخيران على استخدام أشكال نظائر مستقرة أدرجت في الببتيدات19,20. في التحليل الخالي من التسمية، يتم تقدير مستويات الببتيد من خلال النظر في قوة الإشارة (العد الطيفي) خلال LC-MS18. ومع ذلك، يمكن وضع العلامات النظيرية الحصول على مستويات نسبية أكثر دقة من الببتيدات.
استخدمت العديد من الدراسات peptidomic trimethylammonium butyrate (TMAB) وضع العلامات على الكواشف والعلامات الكيميائية، ومؤخرا، تم استخدام الميثيل الاختزالي للأمينات (RMA) مع أشكال من الفورمالديهايد والصوديوم السيانوبوروهيدريد الكواشف deuterated وغير deuterated. ومع ذلك، تسميات TMAB غير متوفرة تجاريا، وعملية التوليف شاقة جدا. من ناحية أخرى ، في RMA ، تكون الكواشف متاحة تجاريا ، وغير مكلفة مقارنة بالملصقات الأخرى ، والإجراء بسيط الأداء ، والببتيدات المسماة مستقرة23،24.
استخدام RMA ينطوي على تشكيل قاعدة شيف من خلال السماح للببتيدات للرد مع الفورمالديهايد، تليها رد فعل الحد من خلال cyanoborohydride. رد الفعل هذا يسبب ثنائي ميثيل من المجموعات الأمينية الحرة على N-المحطات الطرفية والسلاسل الجانبية ليسين وmonomethylates N-محطة prolines. كيف غالبا ما تكون بقايا البرولين نادرة على محطة N ، يتم تسمية جميع الببتيدات ذات الأمينات المجانية على N-terminus بمجموعتين الميثيل23،24،25.
Protocol
Representative Results
Discussion
في معظم الدراسات peptidomics، واحدة من الخطوات الحاسمة هي، دون شك، وإعداد العينة التي ينبغي أن يؤديها بعناية لتجنب وجود شظايا الببتيد التي ولدتها proteases بعد بضع دقائق بعد الوفاة. وأظهرت الدراسات الأولية على مقتطفات الدماغ التي أعدت من عينات غير الميكروويف وجود عدد كبير من شظايا البروتين في ميكر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم تطوير واستخدام التقنيات الموصوفة هنا من خلال منحة المجلس الوطني البرازيلي للبحوث 420811/2018-4 (LMC)؛ منح فونداساو دي أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC) و2019/17433-3 (LOF) و21/01286-1 (MEME). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشرها أو إعدادها.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
