Магнитная изоляция клеток микроглии от новорожденной мыши для первичных клеточных культур
Summary
Первичные культуры микроглии обычно используются для оценки новых противовоспалительных молекул. Настоящий протокол описывает воспроизводимый и релевантный метод магнитной изоляции микроглии от новорожденных детенышей.
Abstract
Микроглия, как макрофаги-резиденты мозга, имеют основополагающее значение для нескольких функций, включая реакцию на стресс окружающей среды и гомеостаз мозга. Микроглия может принимать большой спектр фенотипов активации. Кроме того, микроглия, которая поддерживает провоспалительный фенотип, связана как с нейроразвитием, так и с нейродегенеративными расстройствами. Исследования in vitro широко используются в исследованиях для оценки потенциальных терапевтических стратегий в конкретных типах клеток. В этом контексте изучение активации микроглии и нейровоспаления in vitro с использованием первичных культур микроглии более актуально, чем линии микроглиальных клеток или микроглии, полученные из стволовых клеток. Однако использование некоторых первичных культур может страдать от отсутствия воспроизводимости. Этот протокол предлагает воспроизводимый и релевантный метод магнитного выделения микроглии от новорожденных детенышей. Здесь демонстрируется активация микроглии с использованием нескольких стимулов через 4 ч и 24 ч путем количественного определения экспрессии мРНК и фагоцитарного анализа Cy3-шариков. Ожидается, что текущая работа обеспечит легко воспроизводимый метод выделения физиологически значимой микроглии от стадий развития несовершеннолетних.
Introduction
Микроглии представляют собой резидентные макрофагоподобные клетки центральной нервной системы, полученные из эритропоэтических предшественников желточного мешка, которые мигрируют в нейроэпителий во время раннего эмбрионального развития1. Помимо своих иммунных функций, они также играют значительную роль во время нервного развития, особенно для синаптогенеза, гомеостаза нейронов и миелинизации2. Во взрослом возрасте микроглия развивает длительные клеточные процессы для непрерывного сканирования окружающей среды. В случае разрывов гомеостаза, таких как черепно-мозговая травма или заболевание головного мозга, микроглия может изменить свой морфологический вид, чтобы принять амебоидную форму, мигрировать в поврежденную область, увеличить и высвободить многие цитопротекторные или цитотоксические факторы. Микроглии имеют гетерогенные состояния активации в зависимости от стадии их развития и типа полученной травмы 3,4,5. В этом исследовании эти состояния активации широко классифицируются на три различных фенотипа: провоспалительные / фагоцитарные, противовоспалительные и иммунорегуляторные, имея в виду, что в действительности ситуация, вероятно, будет более сложной6.
Изучение in vivo активации микроглии и скрининг нейропротекторных стратегий на ранних стадиях развития мозга может быть сложной задачей из-за (1) хрупкости животных перед отъемом и (2) низкого количества клеток микроглии. Поэтому исследования in vitro на микроглии широко используются для токсичности 7,8,9, нейропротекторных стратегий 5,10,11,12,13,14 и ко-культур 15,16,17,18,19,20,21 . В исследованиях in vitro могут использоваться либо линии микроглиальных клеток, микроглия, полученная из стволовых клеток, либо первичная культура микроглии. Все эти подходы имеют свои преимущества и недостатки, а выбор зависит от исходного биологического вопроса. Преимуществами использования первичных культур микроглии являются однородный генетический фон, история без патогенов и контроль времени, когда микроглия стимулируется после смерти животных22.
На протяжении многих лет были разработаны различные методы (проточная цитометрия, встряхивание или магнитная маркировка) для культивирования первичной микроглии из грызунов, как новорожденных, так и взрослых 23,24,25,26,27,28,29. В настоящей работе выделение микроглии из детенышей новорожденных мышей выполняется с использованием ранее описанной технологии сортировки клеток с магнитной активацией с использованием покрытого микрогранулами антимышьего CD11b 25,27,29. CD11b представляет собой интегрин-рецептор, экспрессируемый на поверхности миелоидных клеток, включая микроглию. Когда в мозге нет воспалительных проблем, почти все клетки CD11b + являются микроглией30. По сравнению с другими ранее опубликованными методами 23,24,25,26,27,28,29, настоящий протокол уравновешивает немедленный анализ активации микроглии ex vivo и общую культуру первичной микроглии in vitro. Таким образом, микроглии (1) выделяют на послеродовой день (P)8 без удаления миелина, (2) культивируют без сыворотки и (3) подвергают воздействию siRNA, miRNA, фармакологических соединений и/или воспалительных стимулов только через 48 ч после выделения мозга. Каждый из этих трех аспектов делает текущий протокол актуальным и быстрым. Прежде всего, использование детской микроглии позволяет получать динамические и реакционноспособные жизнеспособные клетки в культуре, не требуя дополнительного этапа демиелинизации, который потенциально может модифицировать реактивность микроглии in vitro. Настоящий протокол направлен на то, чтобы максимально приблизиться к физиологической среде микроглии. Действительно, микроглия никогда не сталкивается с сывороткой, и этот протокол также не требует использования сыворотки. Более того, воздействие микроглии уже через 48 ч после посева предотвращает потерю ими физиологических способностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей работе представлена первичная культура микроглиальных клеток с использованием магнитно отсортированных клеток CD11b+. В дополнение к функциональной оценке микроглии (RT-qPCR и фагоцитарные анализы) также определялась чистота микроглиальной культуры.
Классическ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Рисунки были созданы с помощью BioRender. Исследования финансируются Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco и дополнительным грантом от Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS и Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
