Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
A micróglia, como macrófagos residentes no cérebro, são fundamentais para várias funções, incluindo a resposta ao estresse ambiental e a homeostase cerebral. A micróglia pode adotar um grande espectro de fenótipos de ativação. Além disso, a micróglia que endossa o fenótipo pró-inflamatório está associada a distúrbios neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos. Estudos in vitro são amplamente utilizados em pesquisas para avaliar potenciais estratégias terapêuticas em tipos específicos de células. Neste contexto, estudar a ativação microglial e a neuroinflamação in vitro usando culturas microgliais primárias é mais relevante do que as linhagens celulares microgliais ou a microglia derivada de células-tronco. No entanto, o uso de algumas culturas primárias pode sofrer de falta de reprodutibilidade. Este protocolo propõe um método reprodutível e relevante de isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos. A ativação microglial utilizando vários estímulos após 4 h e 24 h por quantificação da expressão de mRNA e um ensaio fagocítico de esferas Cy3 é demonstrado aqui. Espera-se que o presente trabalho forneça uma técnica facilmente reprodutível para isolar micróglias fisiologicamente relevantes dos estágios de desenvolvimento juvenis.
Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial1. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização2. Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua aparência morfológica para adotar uma forma de ameboide, migrar para a área lesada, aumentar e liberar muitos fatores citoprotetores ou citotóxicos. As micróglias apresentam estados de ativação heterogêneos dependendo do seu estágio de desenvolvimento e do tipo de lesão sofrida 3,4,5. Neste estudo, esses estados de ativação são amplamente classificados em três fenótipos diferentes: pró-inflamatório/fagocítico, anti-inflamatório e imunorregulador, tendo em vista que, na realidade, a situação provavelmente será mais complexa6.
Estudar a ativação microglial in vivo e a triagem de estratégias neuroprotetoras nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral podem ser desafiadores devido (1) à fragilidade dos animais antes do desmame e (2) ao baixo número de células microgliais. Portanto, estudos in vitro sobre micróglias são amplamente utilizados para toxicidade 7,8,9, estratégias neuroprotetoras5,10,11,12,13,14 e coculturas 15,16,17,18,19,20,21 . Estudos in vitro podem usar linhagens celulares microgliais, microglia derivada de células-tronco ou cultura de micróglia primária. Todas essas abordagens têm vantagens e desvantagens, e a escolha depende da questão biológica inicial. Os benefícios do uso de culturas primárias de micróglias são o fundo genético homogêneo, a história livre de patógenos e o controle do momento em que as micróglias são estimuladas após a morte animal22.
Ao longo dos anos, diferentes métodos (citometria de fluxo, agitação ou marcação magnética) foram desenvolvidos para a cultura de micróglias primárias de roedores, tanto recém-nascidos quanto adultos 23,24,25,26,27,28,29. No presente trabalho, o isolamento de micróglias de filhotes de camundongos recém-nascidos é realizado utilizando-se a tecnologia de classificação de células ativadas magneticicamente descritas anteriormente, utilizando CD11b anti-camundongo revestido por microesferas25,27,29. CD11b é um receptor de integrina expresso na superfície das células mielóides, incluindo a micróglia. Quando não há desafio inflamatório dentro do cérebro, quase todas as células CD11b + são microglia30. Comparado a outros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, o presente protocolo equilibra análises de ativação microglial ex vivo imediata e cultura microglial primária in vitro comum. Assim, as micróglias são (1) isoladas no dia pós-natal (P)8 sem remoção de mielina, (2) cultivadas sem soro e (3) expostas a siRNA, miRNA, composto farmacológico e/ou estímulos inflamatórios apenas 48 h após o isolamento cerebral. Cada um desses três aspectos torna o protocolo atual relevante e rápido. Em primeiro lugar, o uso da micróglia pediátrica permite a obtenção de células viáveis dinâmicas e reativas em cultura sem a necessidade de uma etapa adicional de desmielinização que poderia potencialmente modificar a reatividade microglial in vitro. O presente protocolo tem como objetivo aproximar-se o máximo possível do ambiente fisiológico da micróglia. De fato, a micróglia nunca encontra soro, e esse protocolo também não requer o uso de soro. Além disso, expor a micróglia já 48 h após a cultura impede que eles percam suas faculdades fisiológicas.
O presente trabalho apresenta uma cultura primária de células microgliais usando células CD11b+ classificadas magneticamente. Além da avaliação funcional microglial (RT-qPCR e ensaios fagocíticos), a pureza da cultura microglial também foi determinada.
Culturas clássicas de células de micróglias são comumente geradas a partir do cérebro de recém-nascidos de roedores P1 ou P2 e co-cultura com astrócitos por pelo menos 10 dias. As micróglias são então separadas mecanicamente us…
The authors have nothing to disclose.
As figuras foram criadas usando BioRender. A investigação é financiada pela Inserm, Université de Paris, Horizonte 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, e uma subvenção adicional do Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |