Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial¹. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização². Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua aparência morfológica para adotar uma forma de ameboide, migrar para a área lesada, aumentar e liberar muitos fatores citoprotetores ou citotóxicos. As micróglias apresentam estados de ativação heterogêneos dependendo do seu estágio de desenvolvimento e do tipo de lesão sofrida ^3,4,5. Neste estudo, esses estados de ativação são amplamente classificados em três fenótipos diferentes: pró-inflamatório/fagocítico, anti-inflamatório e imunorregulador, tendo em vista que, na realidade, a situação provavelmente será mais complexa⁶.

Estudar a ativação microglial in vivo e a triagem de estratégias neuroprotetoras nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral podem ser desafiadores devido (1) à fragilidade dos animais antes do desmame e (2) ao baixo número de células microgliais. Portanto, estudos in vitro sobre micróglias são amplamente utilizados para toxicidade 7,8,9, estratégias neuroprotetoras^{5,10,11,12,13,14} e coculturas 15,16,17,18,19,20,21 . Estudos in vitro podem usar linhagens celulares microgliais, microglia derivada de células-tronco ou cultura de micróglia primária. Todas essas abordagens têm vantagens e desvantagens, e a escolha depende da questão biológica inicial. Os benefícios do uso de culturas primárias de micróglias são o fundo genético homogêneo, a história livre de patógenos e o controle do momento em que as micróglias são estimuladas após a morte animal²².

Ao longo dos anos, diferentes métodos (citometria de fluxo, agitação ou marcação magnética) foram desenvolvidos para a cultura de micróglias primárias de roedores, tanto recém-nascidos quanto adultos 23,24,25,26,27,28,29. No presente trabalho, o isolamento de micróglias de filhotes de camundongos recém-nascidos é realizado utilizando-se a tecnologia de classificação de células ativadas magneticicamente descritas anteriormente, utilizando CD11b anti-camundongo revestido por microesferas^25,27,29. CD11b é um receptor de integrina expresso na superfície das células mielóides, incluindo a micróglia. Quando não há desafio inflamatório dentro do cérebro, quase todas as células CD11b + são microglia³⁰. Comparado a outros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29^, o presente protocolo equilibra análises de ativação microglial ex vivo imediata e cultura microglial primária in vitro comum. Assim, as micróglias são (1) isoladas no dia pós-natal (P)8 sem remoção de mielina, (2) cultivadas sem soro e (3) expostas a siRNA, miRNA, composto farmacológico e/ou estímulos inflamatórios apenas 48 h após o isolamento cerebral. Cada um desses três aspectos torna o protocolo atual relevante e rápido. Em primeiro lugar, o uso da micróglia pediátrica permite a obtenção de células viáveis dinâmicas e reativas em cultura sem a necessidade de uma etapa adicional de desmielinização que poderia potencialmente modificar a reatividade microglial in vitro. O presente protocolo tem como objetivo aproximar-se o máximo possível do ambiente fisiológico da micróglia. De fato, a micróglia nunca encontra soro, e esse protocolo também não requer o uso de soro. Além disso, expor a micróglia já 48 h após a cultura impede que eles percam suas faculdades fisiológicas.