תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.
מיקרוגליה, כמקרופאגים תושבי המוח, הם חיוניים למספר תפקודים, כולל תגובה ללחץ סביבתי והומאוסטזיס מוחי. מיקרוגליה יכולה לאמץ ספקטרום גדול של פנוטיפים של הפעלה. יתר על כן, מיקרוגליה התומכת בפנוטיפ מרובה דלקת קשורה הן להפרעות נוירו-התפתחותיות והן להפרעות נוירודגנרטיביות. מחקרים במבחנה נמצאים בשימוש נרחב במחקר להערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות בסוגי תאים ספציפיים. בהקשר זה חקר הפעלה מיקרוגליאלית ודלקת עצבית במבחנה באמצעות תרביות מיקרוגליאליות ראשוניות רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מיקרוגליאליים או מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע. עם זאת, השימוש בכמה תרבויות ראשוניות עלול לסבול מחוסר שכפול. פרוטוקול זה מציע שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים. הפעלה מיקרוגליאלית באמצעות מספר גירויים לאחר 4 שעות ו-24 שעות על ידי כימות ביטוי mRNA ובדיקה פאגוציטית של חרוזי Cy3 מודגמת כאן. העבודה הנוכחית צפויה לספק טכניקה הניתנת לשחזור בקלות לבידוד מיקרוגליה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית משלבי התפתחות צעירים.
מיקרוגליה (Microglia) הם תאים דמויי מקרופאגים של מערכת העצבים המרכזית, שמקורם במבשרים אריתרופוייטיים של שק החלמון הנודדים לנוירואפיתל במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת1. מלבד תפקודי החסינות שלהם, הם גם ממלאים תפקיד משמעותי במהלך התפתחות עצבית, במיוחד עבור סינפטוגנזה, הומאוסטזיס עצבי ומיאלינציה2. בבגרות, מיקרוגליה מפתחת תהליכים תאיים ארוכים כדי לסרוק את הסביבה ברציפות. במקרה של קרעים הומאוסטזיס כגון פגיעה מוחית או מחלת מוח, מיקרוגליה יכולה לשנות את המראה המורפולוגי שלהם כדי לאמץ צורה אמבואידית, לנדוד לאזור הפגוע, להגדיל ולשחרר גורמים ציטולוגיים או ציטוטוקסיים רבים. למיקרוגליה יש מצבי הפעלה הטרוגניים בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם ולסוג הפציעהשספג 3,4,5. במחקר זה, מצבי הפעלה אלה מסווגים באופן נרחב לשלושה פנוטיפים שונים: פרו-דלקתיים/פאגוציטיים, נוגדי דלקת ואימונו-רגולטוריים, תוך התחשבות בכך שבמציאות, המצב צפוי להיות מורכב יותר6.
חקר ההפעלה המיקרוגליאלית in vivo וסינון אחר אסטרטגיות הגנה עצבית בשלבים מוקדמים של התפתחות המוח יכול להיות מאתגר בשל (1) שבריריותם של בעלי חיים לפני הגמילה ו-(2) המספר הנמוך של תאים מיקרוגליאליים. לכן מחקרים במבחנה על מיקרוגליה נמצאים בשימוש נרחב לרעילות 7,8,9, אסטרטגיות הגנה עצבית5,10,11,12,13,14, ותרביות משותפות 15,16,17,18,19,20,21 . מחקרים במבחנה יכולים להשתמש בקווי תאים מיקרוגליאליים, במיקרוגליה שמקורה בתאי גזע או בתרבית מיקרוגליה ראשונית. לכל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות, והבחירה תלויה בשאלה הביולוגית הראשונית. היתרונות של שימוש בתרביות מיקרוגליה ראשוניות הם הרקע הגנטי ההומוגני, היסטוריה נטולת פתוגנים ושליטה בזמן שבו המיקרוגליה מגורה לאחר מות בעלי חיים22.
במהלך השנים פותחו שיטות שונות (ציטומטריה של זרימה, טלטול או תיוג מגנטי) לגידול מיקרוגליה ראשונית ממכרסמים, הן יילודים והן בוגרים 23,24,25,26,27,28,29. בעבודה הנוכחית, בידוד מיקרוגליה מגורי עכברים מבוצע באמצעות טכנולוגיית מיון תאים המופעלים על ידי מגנט שתוארה קודם לכן באמצעות CD11b 25,27,29 מצופה מיקרובאד נגד עכברים. CD11b הוא קולטן אינטגרין המתבטא על פני השטח של תאים מיאלואידים, כולל מיקרוגליה. כאשר אין אתגר דלקתי במוח, כמעט כל תאי CD11b+ הם מיקרוגליה30. בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו בעבר 23,24,25,26,27,28,29, הפרוטוקול הנוכחי מאזן ניתוחי הפעלה מיקרוגליאליים מיידיים ex vivo ותרבית מיקרוגליאלית ראשונית נפוצה במבחנה. לפיכך, מיקרוגליה (1) מבודדת ביום שלאחר הלידה (P)8 ללא הסרת מיאלין, (2) מבודדת ללא סרום, ו-(3) נחשפת ל-siRNA, miRNA, תרכובת פרמקולוגית ו/או גירויים דלקתיים רק 48 שעות לאחר בידוד המוח. כל אחד משלושת ההיבטים הללו הופך את הפרוטוקול הנוכחי לרלוונטי ומהיר. ראשית, השימוש במיקרוגליה ילדים מאפשר קבלת תאים בני קיימא דינמיים ותגובתיים בתרבית ללא צורך בצעד נוסף של דה-מיאלינציה שעשוי לשנות את תגובתיות המיקרוגליה במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי נועד להתקרב ככל האפשר לסביבה הפיזיולוגית של המיקרוגליה. ואכן, מיקרוגליה לעולם אינה נתקלת בסרום, וגם פרוטוקול זה אינו דורש שימוש בסרום. יתר על כן, חשיפת מיקרוגליה כבר 48 שעות לאחר התרבית מונעת מהם לאבד את יכולותיהם הפיזיולוגיות.
העבודה הנוכחית מציגה תרבית תאים מיקרוגליאלית ראשונית באמצעות תאי CD11b+ ממוינים מגנטית. בנוסף להערכה התפקודית המיקרוגליאלית (RT-qPCR ומבחני פאגוציטים), נקבע גם טוהר התרבית המיקרוגליאלית.
תרביות תאי מיקרוגליה קלאסיות נוצרות בדרך כלל ממוח ילודים של מכרסם P1 או P2 ומתרבית משותפת עם ?…
The authors have nothing to disclose.
הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. המחקר ממומן על ידי Inserm, אוניברסיטת פריז, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, ומענק נוסף מ- Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |