生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法
Summary
我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。
Abstract
我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体動態を研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行うプロトコルとワークフローを提示する。蛍光強度の変動がそれぞれの蛍光生体分子の動的な「指紋」を表すデュアルカラーFCCSでは、受容体の共拡散または結合をプローブすることができます。FRETは、分子距離に対する高感度で、分子内変化を監視する有名な「ナノルーラー」として機能します。一緒に考えて、立体構造変化と局所受容体濃度および移動性定数のような主要なパラメータは細胞の設定でアクセス可能になる。
高ノイズレベルとサンプルの脆弱性により、細胞内では定量的蛍光アプローチが困難です。ここでは、eGFPおよびSNAPタグタムラで標識された2-アドレナリン受容体(β 2 AR)を用いたデュアルカラー βを用いたキャリブレーションステップを含む、この実験の実施方法を示す。カスタマイズが容易なオープンソースソフトウェアとテンプレートを使用して、段階的なデータ分析手順を提供します。
このガイドラインにより、生細胞実験では信号対雑音レベルが限られているにもかかわらず、生体細胞内の生体分子の分子相互作用を高い信頼性 で 解明することができます。FRETの操作ウィンドウ、特に低濃度のFCCSは、生理学的条件に近い状態で定量的な分析を可能にする。
Introduction
蛍光分光法は、細胞内での摂動を最小限に抑えてタンパク質のダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を定量化する主な方法の1つです。共焦点蛍光相関分光法(FCS)は、分子動力学を単分子感受性、高選択的、および生細胞適合性1として解析する強力な方法の1つである。他のダイナミクス指向のアプローチと比較して、FCSは〜nsから〜sに及ぶより広範な測定可能な時間範囲を有し、最も重要なのは、イメージングベースの方法でアクセスできないことが多い高速時間スケールをカバーする。また、膜、細胞質、核分子動力学が容易に識別できるように空間選択性も提供する2。これにより、分子ブリンク、平均局所濃度、および拡散係数をFCSで定量的に解析することができる。結合などの分子間ダイナミクスは、二重色アプローチで蛍光相互相関分光法(FCCS)分析3、4、5における2つの分子種の共拡散を調べた場合に容易にアクセス可能になります。
相関分光法における主な根底原理は、蛍光標識された生体分子がレーザー焦点の出入りを拡散して放出する強度変動の統計分析である(図1A)。結果として得られる自動相関関数または相互相関関数は、曲線フィッティングによってさらに分析され、最終的に関心のあるレート定数を導き出すことができます。言い換えれば、FCSおよびFCCSの統計的方法は、単一粒子追跡のような単一分子トレースを提供するのではなく、高い時間分解能を有するプローブ標本の動的パターンまたは「指紋」を提供する。フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせると、共焦点設定5,6において、立体構造変化などの分子内ダイナミクスを同時に監視することができる。FRETは2つのフルオロフォアの距離をプローブし、しばしば分子「ナノルーラー」と呼ばれます。エネルギー移動は、分子が近傍(<10nm)に位置する場合にのみ行われ、ドナーの発光スペクトルはアクセプター分子の吸収スペクトルと著しく重なり、ドナーとアクセプターの双極子配向が(十分に)平行である。従って、FRETとFCCSの組合せは非常に高い時空間分解能の技術を提供する。空間選択性、感度、生細胞適合性が必要な場合、FRET-FCCSは、等温滴定熱量測定(ITC)7、表面プラズモン共鳴(SPR)8、または核磁気共鳴(NMR)9、タンパク質ダイナミクスおよび相互作用を測定するための10のような他の方法よりも明らかに有利である。
デュアルカラー蛍光相互相関分光(dc-FCCS)の能力と約束にもかかわらず、ライブセルでdc-FCCSを実行することは、スペクトルブリードスルーまたはチャンネル3、4、スペクトル異なるレーザーライン3、4、11、バックグラウンド、またはノイズフォトのスペクトルに起因する共焦点ボリュームの違いにより技術的に困難です。 13、14、15。FCCSへのパルスインターリーブ励起(PIE)の導入は、チャネル16間のスペクトルクロストークを低減するための異なるレーザー励起を時間的に切り離す重要な調整であった。スペクトルブリードスルー17、18、19に対抗する他の補正方法および背景補正も17、18、19で十分に受け入れられている。FCS、PIE、FRET の詳細と基本については、読者は、次の参照先2、4、6、16、20、21、22、23、24を参照してください。
ここでは、プロトタイプGタンパク質共役受容体、β 2 -アドレナリン受容体(β 2 AR)の実験結果と共に必要なすべての較正実験および分析が提示され、(1)「緑」(eGFP)または「赤」(SNAPタグベースの標識)25フルオロフォアを持つ単一標識分子。(2)二重標識構造物で、N末端SNAPタグおよび細胞内eGFP(NT-SNAP)を有する[この場合、両方の標識が同じタンパク質である。したがって、100%の共拡散が予想される](3)二重標識サンプルで、両方の蛍光体が細胞膜の同じ側にある(CT-SNAP)。C末端のスナップタグと細胞内eGFPを搭載しています。ここで、再び両方の標識が同じタンパク質にあり、再び100%共拡散が予想される。両方のラベルが互いに非常に近く、細胞膜の同じ側に、FRETおよび反相関行動を観察する可能性を示す。全ての構成体は中国のハムスター卵巣(CHO)細胞でトランスフェクションされ、後にCT-SNAP構築物のNT-SNAP構築物に対して膜不透過性および膜透過性である赤色蛍光基質で標識された。最後に、シミュレーションデータは、FRET誘導の非相関に対する実験パラメータの影響と、タンパク質とタンパク質の相互作用が共拡散振幅に及ぼす影響を例示します。
したがって、このプロトコルは、技術的/物理的なアーティファクト、課題、および可能な解決策を認識しながら、タンパク質ダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を理解するために、生細胞で組み合わせたFRET-FCCSを実行するための完全なガイドを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCRsにおけるFCS技術は、生細胞内の受容体の移動性および相互作用を評価することを可能にする41.FRET-FCS技術の利点は、モビリティとともに、GPCRsの立体構造ダイナミクスを調査できることです。しかし、生きた細胞でFRET-FCSを行うことは困難であり、対象となる蛍光標識タンパク質の低い(または最大中程度の)発現を示す細胞、十分に較正されたセットアップ、データを分析するための良好なパイプラインが必要です。ここでは、まず、試料調製および実験手順における重要な点について、生物学的、分光的、および技術的観点に関して議論される。
重要な実験ステップには、バックグラウンドおよび自己蛍光を最小限に抑える(広範囲に洗浄されたカバーリップとフェノールレッドフリーメディアを使用すること)、トランスフェクション条件の最適化(例えば、プラスミドDNAの量およびトランスフェクション後の時間)を低発現レベルおよび効率的な標識を達成する。もちろん、標識タンパク質の機能が妨げられないようにすることも重要です。したがって、生細胞実験において、標識戦略および標識位置の決定は、多くの場合、フレキシブルN末語またはC末語42、43に結合した蛍光タンパク質またはSNAP/CLIPタグを支持して行われる。有機フルオロフォアで標識するための反応性側鎖を持つ非天然アミノ酸を挿入するような代替標識戦略は、ここ44年で出現している。
目的の2つの分子の相互作用のみを調査するデュアルカラーPIE-FCSの場合、蛍光色体は、確立された蛍光タンパク質またはSNAP/ CLIP基質の多種多様から選択することができます。ここで分光法的には、クロストークや直接アクセプター励起が生じるペアを選択することが目標となるべきである。さらに、選択された蛍光色素は写真が撮れ可能で、選択された実験条件下で漂白をほとんどまたは全く示さないべきである。赤色スペクトル範囲の蛍光体を(1)細胞からの自己蛍光背景が減少し、(2)励起光がより長い波長であり、したがって光毒性が少ない14として選択することが推奨される。光の輝きは、レーザーパワーを段階的に増加させ、分子の明るさが観察される、いわゆる「パワーシリーズ」を最初に行うことで最小化することができます。最適な励起強度範囲は、結果45の線形範囲にあります。
2つの標識がFRETを通じてタンパク質の立体構造ダイナミクスについても報告することになっている場合、利用可能なフルオロフォアの選択はより制限されます。ここでは、2つのフルオロフォア間の可能な最小/最大距離は、事前に、利用可能な構造または分子サイズに基づいて、FRETが実際に20を発生するように合理的なフェルスター半径R0で選択されたフルオロフォア対と推定されるべきである。
ここで、標識用にeGFPとSNAPタグを選択し、SNAPタグを細胞内または膜不透過性表面基板のいずれかで標識した。スペクトルは図2C-Dに示されているものと似ています。このフルオロフォアの組み合わせは、eGFPの赤い検出チャネルへの高いクロストークを示し、迅速な時間枠で緑色の励起によるSNAP基板の直接アクセプタ励起を示し、プロンプトタイムウィンドウの赤色チャネルに有意な「偽」信号をもたらす。理想的には、両方の値、クロストークと直接アクソクサイクリック励起は、5%5、6、38を超えてはならない。しかし、57 Åのフェルスター半径を使用すると、2 AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 構築物βのラベル間の距離を、クエンチ eGFP の寿命から評価できるプローブに最適です (補足注 5)。
技術的には、蛍光分光法の実験に関しては、デバイスは十分に整列し、適切な励起源、排出フィルタ、および敏感な検出器を所有する必要があります。μs タイムスケールでの検出器からのアーティファクトを避けるために、各色の少なくとも 2 つの検出器が存在し、相互相関が発生する可能性があります。現代の時間相関単一光子カウントエレクトロニクスでは、ns時間範囲内の検出カードのデッドタイムは独立したルーティングチャネルのためにほとんど役割を果たしませんが、関心のある時間範囲がサブμs/ns時間範囲にある場合、Müllerら 16が提案したようにチェックされる可能性があります。さらに、ps範囲においてさらに高い時間分解能のために、各検出チャネルは、2倍にする必要があり、すなわち、色当たり4検出器を使用する必要があり、また、検出器のデッドタイム2、15、29、46をバイパスする。蛍光寿命の平均は非偏光蛍光検出を用いて推定できるが、蛍光と蛍光間の距離(〜分布)の分析のために発光は偏光依存性を収集しなければならない。これは、FRETにおけるエネルギー伝達の効率が2つの蛍光ホルの向きに依存しているという事実によるものです。詳細については、20,28,47を参照してください。最後に、PIE実験では、迅速パルスと遅延パルスの間の距離が重要であり、蛍光の強度が大きく減衰するように選択する必要があります(図1B)。一般的なルールは、2つのパルスを5倍の蛍光寿命に置く、すなわち2.5nsの蛍光寿命を持つeGFPの場合、距離は最低22で12.5nsでなければならない。
実験手順に関する全ての考察を詳述した後、データとその分析についてより詳細に説明する。プロトコルセクションで述べたように、キャリブレーション測定の分析を含め、セットアップのアライメントを毎日チェックする必要があります。図2A-Cに示すデータは、例えば、8〜40μsの範囲で追加の緩和成分を示す。緑色のキャリブレーションフルオロフォアの典型的なトリプレット点滅は、2-10 μs範囲13、15、48で発生することが知られている。DNAサンプルの全ての曲線に必要な緩やかな緩和成分(図3C)は、実際の三重項点滅には遅すぎると、フルオロフォア39とDNAの相互作用に由来する可能性がある。しかし、このコンポーネントはCCFPIEでは期待されず、残留クロストークに由来する可能性が高い。したがって、その日のアライメントの品質を判断するために細胞実験に進む前に、キャリブレーションサンプルの分析を直接行うことを強くお勧めします。
共焦点のオーバーラップボリュームの適切なキャリブレーションには、緑と赤のラベルの100%共拡散を伴うサンプルが必要です。ここで、蛍光標識された二本鎖DNAが用いられる。両方のDNA鎖は、所望のフルオロフォアを互いに必要な距離に合わせて調整することができる。設計された鎖は高い収率と焼き付けることができる。しかし、グッドラボラトリープラクティスは、アガロースゲル電気泳動によるDNA鎖の完全性と標識度合いをチェックし、吸収スペクトルを測定することを推奨します。また、このキャリブレーション測定は、緑色と赤のラベルの100%の共拡散があるという仮定に大きく依存するため、二本鎖アセンブリの歩留まりをチェックする必要があります。仮定が有効でない場合、補正係数を16、22に適用する必要があります。図2と図3に示すキャリブレーション測定では、緑と赤のチャネルでそれぞれ1.4 fLと1.9 fLの検出体積が得られました。このサイズの違いは、ほぼ回折制限された励起量を持つセットアップに期待される(補足注 2)。この条件下では、励起体積の大きさは励起波長に合わせてスケールします。これは、図3Bで観察される異なる相関振幅を次に説明する。導出された補正因子rGR = 0.56およびrRG = 0.72は、このサイズの不一致と、2つの励起ボリューム3,4の潜在的な非完全な重複に対して正しい。
図4、図5、図6、図7は、立体構造タンパク質のダイナミクスを理解することを目的としたPIE-F(C)CSベースの研究のワークフローを示しています。まず、2つのAR-IL3-eGFPとNT-SNAP-β 2 AR β 2つの単一標識構造は、他の蛍光泳動が存在しない場合に細胞内の蛍光素特性を特徴付けるコントロールとして機能する(図4)。次に、二重標識構造NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFPは細胞外装に面したSNAPタグと細胞質側のeGFPを持ち、「100%共拡散」制御として機能する(図5)。最後の構造は、2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP β、細胞質側に両方のフルオロフォアを運び、FRETを受けるのに十分なほど近い。ここでも、100%の共拡散が、迅速なタイムウィンドウにおける緑と赤のチャネル信号の反相関強度変動、すなわちドナー励起後、FRET効率31、32、33に影響を与えるタンパク質ダイナミクスに起因する、反相関強度変動と並行して予想されるであろう。このダイナミクスは、CCFFRETで反相関として表示される可能性があります (図 6-7)。
全てのGPCR β 2 AR構築物は、細胞膜上のバイモーダル拡散を示す(図4A)。β2AR-IL3-eGFP は、期待されるトリプレット点滅のみを示していますが (図 5B)13、15、NT-SNAP-β2AR は、さらなる緩やかな緩和時間を示しています (図 5C-D)。tR2は非結合のSNAP基板に由来する可能性があります。これは、更なる実験によって解明され得る、例えば、水溶液中の使用されたSNAP基質の拡散および光物性も測定することによっても可能である。注意は、拡散と緩和時間を区別する簡単な実験は、共焦点セットアップのピンホールを変更すること、すなわち、有効体積を増加させることである:拡散時間は有効体積の増加に伴って増加する一方で、緩和項は変化していない13。適合結果に基づいて蛍光タンパク質(FP)の濃度を決定する際には、FPは一般的に成熟プロセスを経て、最終的に発色器が形成される12に注意する。この成熟時間は、地域の化学環境13、15に依存する光物理学に加えて、FPからFPに異なる場合があります。従って、FCSによって報告されたサンプル中に存在する実際のタンパク質濃度は、通常過小評価され、非蛍光のフップの割合が実験で決定できる場合に補正することができる。最後に、ほとんどのフルオロフォアが環境13、15、48に敏感に反応するので、必要に応じて、αとδの値を修正するために生細胞のフルオロフォアスペクトルをチェックすることをお勧めします。減算する背景は、非トランスフェクトされた細胞で収集されたシグナルによって決定されます。さらに、他の各カラーチャンネルとCCFPIEの自己相関をチェックして、偽信号を識別できるようにする必要があります(補足ノート4 – 図30)。
この2つの測定結果は、膜の異なる側面に蛍光体が位置するNT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP(図5D)で、異なる日に取得され、時間分解された単一分子蛍光における統計の重要性を示しています。ここで、異なる結果は、異なるラベルの程度に起因する可能性があります:1つのセルでは、測定の標識と平均の度合いが比較的低いノイズをもたらした(図5B)、他のセルからは2つの測定値しか収集できなかった(図5A)。十分な量のデータを収集するだけでなく、結果をタイムリーに評価し、ラベル付け戦略を最適化することが重要です。実験を設計する際には、FRETは敏感であるが、10 nmまでの距離に限定され、そうでない場合は「ブラインド」に制限されることを覚えておくことが重要です。我々の場合、この「失明」は、変化していないeGFP蛍光寿命(補足注5)によって示される。β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP コンストラクト (図 6A)では、FRET を eGFP の消し込み寿命から特定できます (補足注 5)。しかし、非相関項(図6B)は、FRETが変動しないか、拡散時間よりも時間スケールが遅いことを意味する。ACFgp、ACF rp、ACF rd、CCF FRETには最大3つの追加緩和条件が必要です(図6C)。ACFrp、ACF rdおよびCCFFRETの遅い成分は、アクセプタ漂白によるものかもしれないし、もちろん、これらの曲線に見られる遅い拡散の得られた値に影響を与える(ACFgpの117 msと比較して〜350 ms)。赤チャンネルのtDは、異なるサイズの共焦点ボリューム(図2)が、サイズ差に匹敵する係数だけであるため、緑色のチャネルよりもわずかに大きいと考えられています。3 μsの非常に高速な緩和時間は、フルオロフォア13、15、48の三重瞬きを反映していますが、37μsの緩和時間はFRETによるものかもしれません:同様に、FRETがCCFFRETで反相関を誘発するので、正の相関は自己相関31、32、33で期待されます。CCFFRETにおける「陽性」としてのこの用語の存在とACFrdでのその存在は、高いクロストークで説明され、さらに解明されるべきである。CCFPIEは、予想通りの短い相関時間でフラットであることに注意してください。
一方、対象系におけるFRETの発生は、相関曲線6に対する非線形効果を導く点に留意すべきである。分子の明るさは、例えば、分子の二乗と各FRET状態(および常に活性な受容体を持たない存在分子)にスケールする相関の明るさを示す。実際、FRETは検出された緑色分子の見かけの濃度を減少させ(すなわち、ACFgp振幅を増加させる)、そして赤色分子の数(赤いプロンプトから決定される)は5を過大評価する。両方の効果は、CCFFRETとCCF PIEの両方から得られる相互作用の量に影響を与えます。しかし、カルモジュリン31、32またはシンタックスイン33の分子内ダイナミクスに関して例示したグローバル分析は、タンパク質ダイナミクスを明らかにすることができる。慎重に較正する場合、平均FRET効率は、相対的なCCFPIEおよびACF振幅22から抽出され得るが、一方、制限状態はドナー蛍光寿命分布33の分析から決定され得る。
eGFPのような大きな蛍光色素を用いた生細胞実験では、FRETコントラストが図6に示すシミュレーションで想定されるよりもさらに低くなる可能性があり、アクセプタの直接励起がシミュレーションに追加されなかったことを考えると、ライブ細胞実験における抗相関の同定が非常に困難である理由を説明する可能性があります。有望な分析代替手段は、時間相関単一光子計数データ収集29,30によりアクセス可能な光子到着時間ヒストグラム(図1B)にコードされた情報の収集に依存する。サンプル内の2種(またはそれ以上)(FRET)種の蛍光寿命(〜パターン)が既知である場合(図7A)、相関過程で適用される「フィルタ」または重みを選択することができる(図7B)17、18、19。このようにして得られた相関曲線は、もはや検出チャネルの相関を表すのではなく、2つの異なる(FRET)種間の自動相関または相互相関を表し、こうして種ACF(sACF)または種CCF(sCCF)に改名される。このアプローチを、中程度のFRETコントラスト、高いクロストーク、三重点滅を用いてシミュレートされたデータに適用すると、非相関項が回復する(図7C-D)。しかし、緩和時間は得られるが振幅との関係は18と失われていることに留意すべきである。このアプローチは、EGFRとそのアンタゴニスト49との相互作用を研究するために、または蛍光をeGFP変異体に結合したタンパク質から分離するために、例えば、生細胞実験で以前に適用されてきた50の非常に短く、長い蛍光寿命を有するタンパク質から蛍光を分離する。
精製タンパク質のPIEベースのFRET測定は、タンパク質ダイナミクス3622を研究するために主に使用されますが、生細胞ではタンパク質とタンパク質の相互作用を理解することに焦点を当てています。このアプローチは、酵母51におけるMAPキナーゼ活性の調節を研究するために適用されたか、この最近の記事52に要約されるように、それらの細胞質結合パートナーと膜タンパク質の相互作用を解決するために適用されている。ここで、緑色のフルオロフォアの有意なクロストークが、プロンプトタイムウィンドウの緑色チャネルの遅延時間ウィンドウまたは赤色信号に依然として存在する場合に合併症が生じることがある。前者は緑色のパルスに対する赤いパルスの遅延が不十分であることが原因である可能性がありますが、両方の効果は選択されたフルオロフォアの励起と発光スペクトルが過度に重なることによって生じます。蛍光寿命が非常に短い自己蛍光が別の複雑な因子である可能性がある細胞において特に、それぞれの単一標識構造を慎重にチェックし、偽陽性CCFPIE振幅を補正することが推奨される。
結論として、ここで説明するFRET-FCSアプローチは、生理学的濃度に近い生細胞におけるタンパク質相互作用およびタンパク質ダイナミクスを理解する大きな可能性を秘めています。このプロトコルでは、必要なキャリブレーション測定と、生細胞測定中に実行される必要な定量分析に焦点を当てた。このため、異なる生細胞測定値がシミュレーションと相補的に示された。シミュレーションは、それぞれのデータの特定の移動性と光物理特性を記述する合体適合モデルを使用して、パラメータを体系的に変化させることができるので、ここで一般的な理解を提供します。この分析は、広範なステップバイステップのプロトコルと適応しやすいテンプレートを備えたオープンソースソフトウェアツールで実行されました。最後に、技術的な進歩、したがって、すぐに購入できる安定したPIE-FCSシステムの可用性とデータ分析のためのオープンソースソフトウェアの普及により、この技術は、最終的に最も感度の高い生細胞のタンパク質相互作用とダイナミクスを解明するために、より大きな研究コミュニティのためにますますアクセスしやすくなります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(SFB/TR 240、プロジェクト番号374031971、プロジェクトINF)によってJ.BとK.G.Hに支援されました。
ルドルフ・ビルチョウ・センターの財政支援とコアユニット蛍光イメージングに対し、技術サポートに感謝します。さらに、アシュウィン・バラクリシュナンの徹底的な校正に感謝します。
Materials
| 1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
| 2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
| 2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
| 6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
| Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
| ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
| Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
| Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
| Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
| Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
| Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
| ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
| DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
| DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
| Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
| Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
| Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
| Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
| Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
| Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
| Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
| Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
| MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
| Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
| Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
| Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
| Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
| Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
| PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
| Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
| Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
| Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
| SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
| Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
| Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |
References
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