JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

Published: December 11, 2021
doi:
10.3791/62954
, , , , , ,
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging,Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

Summary

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

Abstract

אנו מציגים פרוטוקול וזרימת עבודה לביצוע פלואורסצנטיות כפולה של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטן ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות. ב- FCCS בצבע כפול, שבו התנודות בעוצמת הפלואורסצנטיות מייצגות את “טביעת האצבע” הדינמית של הביומולקולה הפלואורסצנטית בהתאמה, אנו יכולים לחקור דיפוזיה משותפת או כריכה של הקולטנים. FRET, עם הרגישות הגבוהה שלה למרחקים מולקולריים, משמש “nanoruler” ידוע כדי לפקח על שינויים תוך מולקולריים. יחד, שינויים קונפורמציה ופרמטרים מרכזיים כגון ריכוזי קולטן מקומי וקבועי ניידות הופכים לנגישים בהגדרות הסלולר.

גישות פלואורסצנטיות כמותית מאתגרות בתאים בשל רמות רעש גבוהות ופגיעות המדגם. כאן אנו מראים כיצד לבצע ניסוי זה, כולל שלבי הכיול באמצעות צבע כפול שכותרתו β2– קולטן adrenergic (β2AR) המסומן עם eGFP ו SNAP-tag-TAMRA. הליך ניתוח נתונים שלב אחר שלב מסופק באמצעות תוכנות קוד פתוח ותבניות קלות להתאמה אישית.

ההנחיה שלנו מאפשרת לחוקרים לפענח אינטראקציות מולקולריות של ביומולקולות בתאים חיים במקום עם אמינות גבוהה למרות רמות האות לרעש המוגבלות בניסויים בתאים חיים. החלון התפעולי של FRET ובמיוחד FCCS בריכוזים נמוכים מאפשר ניתוח כמותי בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

Introduction

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות היא אחת השיטות העיקריות לכימות דינמיקת חלבונים ואינטראקציות חלבון-חלבון עם הפרעה מינימלית בהקשר תאי. ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות קונפוקלית (FCS) היא אחת השיטות החזקות לנתח דינמיקה מולקולרית מכיוון שהיא רגישה למולקולה אחת, סלקטיבית מאוד ותואמת תא חי1. בהשוואה לגישות אחרות המוכוונות לדינמיקה, ל- FCS יש טווח זמן מדיד רחב יותר המשתרע על פני ~ ns ל- ~ s, והכי חשוב מכסה את סולמות הזמן המהירים שלעתים קרובות אינם נגישים על ידי שיטות מבוססות הדמיה. יתר על כן, הוא מספק גם סלקטיביות מרחבית, כך ממברנה, ציטופלסמוס, גרעין דינמיקה מולקולרית ניתן להבחין בקלות 2. לכן, מצמוץ מולקולרי, הריכוז המקומי הממוצע, ואת מקדם דיפוזיה ניתן לנתח כמותית עם FCS. דינמיקה בין-מולקולרית כגון כריכה הופכת נגישה בקלות בעת בדיקת דיפוזיה משותפת של שני מינים מולקולריים בספקטרוסקופיה חוצת קורלציה פלואורסצנטית (FCCS)3,4,5 בגישה דו-צבעית.

העיקרון הבסיסי העיקרי בספקטרוסקופיית מתאם הוא הניתוח הסטטיסטי של תנודות עוצמה הנפלטות על ידי ביומולקולים בעלי תווית פלואורסצנטית המתפזרים פנימה והחוצה של מוקד לייזר (איור 1A). לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את פונקציות המתאם האוטומטי או המתאם בין המתאם באמצעות עקום כדי להפיק בסופו של דבר את קבועי הריבית. במילים אחרות, השיטות הסטטיסטיות FCS ו- FCCS אינן מספקות עקבות מולקולה בודדת כמו במעקב אחר חלקיקים יחיד, אלא תבנית דינמית או “טביעת אצבע” של דגימה שנבדקה ברזולוציה זמנית גבוהה. בשילוב עם העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET), ניתן לפקח על דינמיקה תוך-מולקולרית כגון שינויים קונפורמציה בו זמנית במערך קונפוקל משותף5,6. FRET בודק את המרחק של שני פלואורופורים והוא מכונה לעתים קרובות “nanoruler” מולקולרי. העברת אנרגיה מתבצעת רק כאשר המולקולות נמצאות בקרבת מקום (< 10 ננומטר), ספקטרום הפליטה של התורם חופף באופן משמעותי עם ספקטרום הקליטה של מולקולת הקבלה, וכיוון הדיפול של התורם והמקבל מקביל (במידה מספקת). לכן, השילוב של FRET ו- FCCS מספק טכניקה עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה מאוד. כאשר נדרשת סלקטיביות מרחבית, רגישות ותאים חיים, ל-FRET-FCCS יש יתרון ברור על פני שיטות אחרות כגון קלורימטריה איזותרמית (ITC)7, תהודה פלסמון פני השטח (SPR)8, או תהודה מגנטית גרעינית (NMR)9,10 למדידת דינמיקה ואינטראקציות של חלבונים.

למרות היכולות וההבטחה של ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה (dc-FCCS), ביצוע DC-FCCS בתאים חיים הוא מאתגר מבחינה טכנית בשל דימום ספקטרלי דרך או crosstalk בין ערוצים3,4, ההבדל בנפחים confocal בשל קווי לייזר ייחודיים ספקטרלית3,4,11, אות רקע, ורעש או פוטושוטציה מוגבלת של הדגימות12, 13,14,15. כניסתו של עירור בין פעימות (PIE) ל- FCCS הייתה ציוצים חשובים כדי לנתק זמנית את עירור הלייזר השונה להפחתת ההצלבה הספקטרלית ביןערוצים 16. שיטות תיקון אחרות נגד דימום ספקטרלי דרך17,18,19 ותיקונים ברקע התקבלו גם הם17,18,19. לקבלת פרטים ויסודות ב- FCS, PIE או FRET, הקורא מופנה להפניות הבאות2,4,6,16,20,21,22,23,24.

כאן, כל ניסויי הכיול וניתוח הדרושים יחד עם התוצאות הניסיוניות של קולטן מצמיד חלבון G אב טיפוס, קולטן β2-adrenergic (β2AR), עבור שלושה תרחישים שונים מוצגים: (1) מולקולות בעלות תווית אחת הנושאות “ירוק” (eGFP) או “אדום” (תיוג מבוסס תג SNAP)25 פלואורופור; (2) מבנה בעל תווית כפולה, הנושא תג SNAP-תג N-terminal ו- eGFP תאי (NT-SNAP) [במקרה זה, שתי התוויות נמצאות באותו חלבון. כך צפויה דיפוזיה משותפת של 100%;; ו-(3) דגימה בעלת תווית כפולה, שבה שני הפלורופורים נמצאים באותו צד של קרום התא (CT-SNAP). הוא נושא תג SNAP-מסוף C ו- eGFP תאי. כאן, שוב שתי התוויות הן באותו חלבון עם שוב 100% דיפוזיה משותפת צפויה. כמו שתי התוויות קרובות מאוד זה לזה, באותו צד של קרום התא, זה מראה את הפוטנציאל להתבונן FRET והתנהגות אנטי תיקון. כל המבנים הועברו לתאי השחלות הסיניות (CHO) ומאוחר יותר תויגו במצע פלואורסצנטי אדום שהוא בלתי חדיר למבנה NT-SNAP וחדיר לממברנה למבנה CT-SNAP. לבסוף, נתונים מדומים מדגים את ההשפעה של פרמטרים ניסיוניים על האנטי-שחיתות הנגרמת על ידי FRET, ואת ההשפעה של אינטראקציות חלבון-חלבון על משרעת דיפוזיה משותפת.

לפיכך, פרוטוקול זה מספק מדריך מלא לביצוע FRET-FCCS המשולב בתאים חיים כדי להבין דינמיקת חלבונים ואינטראקציות חלבון-חלבון תוך מודעות לממצאים טכניים / פיזיים, אתגרים ופתרונות אפשריים.

Protocol

1. פרוטוקול ניסיוני הכנת דוגמההערה: בצע זריעת תאים ו transfection בתנאים סטריליים. מניחים כיסוי נקי לבאר לתוך צלחת תרבות של 6 באר ושטפו שלוש פעמים עם תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS).הערה: פרוטוקול ניקוי כיסוי מפורט בהערה משלימה 1. לכל באר, להוסיף 2 מ”ל של מדיום תרבית התא המלא המכיל פנול אדום (בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 מיקרוגרם / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין) ולשמור את הצלחת בצד. תרבית תאי CHO באותו מדיום המכיל פנול אדום ב 37 °C ו 5% CO2. לשטוף את התאים עם 5 מ”ל של PBS כדי להסיר את התאים המתים. מוסיפים 2 מ”ל טריפסין ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לדלל את התאים המנותקים עם 8 מ”ל של בינוני המכיל פנול אדום ומערבבים בזהירות על ידי pipetting. לספור את התאים בתא Neubauer וזרע בצפיפות של 1.5 x 105 תאים / גם בצלחת תרבית התא 6 טוב המכיל את כיסויים (מוכן בשלב 1.1.1-1.1.2). תן לתאים לגדול באינקובטור (37 °C (37 °C, 5% CO2) עבור 24 שעות על מנת להשיג כ 80% השפעה. לדלל 2 מיקרוגרם של ה- DNA הווקטורי הרצוי (למשל, CT-SNAP או NT-SNAP) ו 6 μL של ריאגנט transfection בשתי צינורות נפרדים, כל אחד מכיל 500 μL של מדיום סרום מופחת עבור כל באר ודגרה במשך 5 דקות ב RT. מערבבים את שני הפתרונות יחד כדי להשיג את תערובת transfection ודגורה זה במשך 20 דקות ב RT. בינתיים, לשטוף את תאי CHO זרע פעם אחת עם PBS סטרילי. החלף את PBS עם 1 מ”ל / באר של פנול אדום חינם בינוני בתוספת 10% FBS ללא כל אנטיביוטיקה. מוסיפים את כל 1 מ”ל של תערובת transfection טיפה לכל באר ודגורת התאים לילה ב 37 °C (5%, ב 5% CO2. עבור תיוג של מבנה SNAP, לדלל את פתרון מלאי מצע SNAP המתאים ב 1 מ”ל של המדיום בתוספת עם 10% FBS כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM. לשטוף את התאים transfected פעם אחת עם PBS ולהוסיף 1 מ”ל לבאר של פתרון מצע SNAP 1 μM. לדגור על התאים במשך 20 דקות ב 37 °C (5% CO2). לשטוף את התאים שלוש פעמים עם פנול אדום חינם בינוני ולהוסיף 2 מ”ל לכל מדיום פנול אדום חינם היטב. לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 37 °C (5% CO2). העבר את כיסויי כל הדגימות לאחר מכן לתא ההדמיה ולשטוף עם 500 מאגר הדמיה μL. הוסף מאגר הדמיה של 500 μL לפני המעבר להגדרת FRET-FCS. מדידות כיולהערה: מערך FRET-FCS מצויד במטרה של מי מיקרוסקופ קונפוקליים, שני קווי לייזר, מערכת ספירת פוטון יחיד בקורלציה בזמן (TCSPC), שני צינורות פוטומולטיפלייר היברידיים (PMT) ושתי פוטודיודות מפולת שלגים (APD) לאיסוף פוטונים ותוכנת איסוף הנתונים. חשוב מאוד ליישר את ההתקנה בכל פעם לפני מדידות תאים חיים. תיאור ההתקנה המפורט ניתן למצוא בפתק משלים 2. הן הלייזרים והן כל הגלאים (שני PMTs ושני APDs) הם תמיד על במהלך המדידות, כמו כל המדידות צריך להתבצע בתנאים זהים. עבור מדידות הכיול, השתמש בכיסוי מאותו מגרש שבו זרעו התאים, פעולה זו מקטינה את השונות בתיקון טבעת הצווארון. להתאמת מיקום המיקוד, חור הסיכה וטבעת הצווארון, הניחו פתרון כיול ירוק 2 ננומטר על כיסוי זכוכית והפעלו את הלייזר 485 ננומטר ו-560 ננומטר. הפעל לייזר במצב עירור משולב (PIE)פעמו 16. התמקדו בתמיסה והתאמו את מיקום חור הסיכה וטבעת הצווארון כך שקצב הספירה הגבוה ביותר ונפח הקונפוקאלי הקטן ביותר מתקבלים כדי לקבל את הבהירות המולקולרית המרבית. חזור על תהליך זה עבור הערוצים האדומים עם פתרון כיול אדום 10 ננומטר ותערובת של שניהם, פתרון הכיול הירוק והאדום. הנח את פתרון ה- DNA של 10 ננומטר על מכסה זכוכית והתאם את מיקום המיקוד, חור הסיכה וטבעת הצווארון כך שהמתאם הצולב בין ערוצי הזיהוי הירוקים והאדומים הוא הגבוה ביותר, כלומר, מראה את המשרעת הגבוהה ביותר.הערה: ייתכן שיהיה אצטרך לחזור על שלבים 1.2.1 ו- 1.2.4 הלוך ושוב כדי למצוא את היישור האופטימלי. יש לבצע 3-5 מדידות מכל פתרון כיול עבור 30 s – 120 s לאחר שמיקוד, חור הסיכה וטבעת הצווארון מיושרו בצורה אופטימלית עבור ערוצי הזיהוי הירוק והאדום ונפח החפיפה הקונפוקלי. מדוד טיפה של ddH2O, מדיום ההדמיה, ותא לא transfected 3-5 פעמים כל אחד עבור 30 s – 120 s כדי לקבוע את שיעורי ספירת הרקע. לאסוף את פונקציית תגובת המכשיר עם 3-5 מדידות עבור 30 s – 120 s. זה אופציונלי אך מומלץ מאוד. מדידות תאים חיים מצא תא מתאים על ידי הארה עם מנורת כספית והתבוננות דרך העין.הערה: תאים מתאימים חיים המציגים את המורפולוגיה האופיינית של קו התא החסיד המתאים. הפלואורסצנטיות של חלבון העניין, כאן קולטן פני השטח, נראית על פני השטח. תאים בהירים פחות מתאימים יותר מאשר תאים בהירים יותר בשל הניגודיות הטובה יותר ב- FCS כאשר מספר נמוך של מולקולות נמצאים בפוקוס. הפעל את שני הלייזרים במצב PIE והתמקד בממברנה על-ידי התבוננות בספירות המרביות לשניה.הערה: ייתכן שיהיה צורך להפחית את כוח הלייזר עבור דגימות התא (פחות מ- 5 מיקרו-ואט במטרה). זה תלוי בפלואורופורים המשמשים ובהתקנה. שים לב עקומות המתאם האוטומטי והצלבה של eGFP או שכותרתו SNAP-tag המצורפת β2AR בתצוגה המקדימה המקוונת של תוכנת איסוף הנתונים ולאסוף כמה מדידות קצרות (~ 2 -10) עם זמן רכישה בין 60 -180 s.הערה: אין לרגש את התאים במשך זמן רב ברציפות כמו פלואורופורים עשויים להלבין. עם זאת, זה יהיה תלוי בבהירות של כל תא, כמה זמן המדידות יכולות להיות, וכמה מדידות בסך הכל ניתן לבצע. 2. ניתוח נתונים ייצוא נתונים יצא את עקומות המתאם, G(tc)ושיעורי הספירה, CR, מכל המדידות. הדאג להגדיר כראוי את חלונות הזמן “בקשה” ו”השהיית” והשתמש באפשרות “גטינג של זמן מיקרו-זמן” בתוכנת מתאם הנתונים.הערה: בסך הכל, שלושה מתאמים שונים נדרשים: (1) תיקון אוטומטי של הערוץ הירוק בחלון הזמן של הבקשה (ACFgp), (2) תיקון אוטומטי של הערוצים האדומים בחלון זמן ההשהיה (ACFrd), ולבסוף (3) המתאם הצולב של אות הערוץ הירוק בחלון הזמן של הבקשה עם אות הערוץ האדום בחלון זמן ההשהיה (CCFPIE). ייצוא הנתונים מוצג צעד אחר צעד עבור תוכנות שונות בפתק משלים 3. מדידות כיולהשתמש בפונקציות התיקון האוטומטי של פתרונות הפלורופור הירוקים (ACFgp) ואדום(ACFrd), והתאים אותם למודל דיפוזיה תלת-ממדי עם מונח שלישייה נוסף במידת הצורך (eq. 1) לכיול הצורה והגודל של אמצעי האחסון לזיהוי קונפוקלי עבור שני ערוצי הצבע המשמשים: א.ק. 1כאן, b הוא קו הבסיס של העקומה, N מספר המולקולות במוקד, tD זמן הדיפוזיה (ב- ms) ו s = z0/w0 גורם הצורה של רכיב נפח הקונפוקלי. השלישייה מהבהבת או פוטופיזיקה אחרת מתוארת על ידי משרעת שלה R וזמן הרפיה tR.הערה: כל המשתנים והסימנים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלה 1. השתמש במקדםי הדיפוזיה הידועים D עבורתקן 26 וכיול אדום ירוק27 וגורמי הצורה המתקבלים ירוקים ואדומים כדי לקבוע את הממדים (רוחב w0 וגובה z0) ואת אמצעי האחסון Veff של רכיב הנפח הקונפוקלי (eq. 2a-c).א. 2אכ”ק 2בeq. 2cהערה: תבניות לחישוב פרמטר הכיול מסופקות כקבצים משלימים (S7). חשב את ההצלבה הספקטרלית α של אות הפלואורסצנטיות הירוק (שנאסף בערוצים 0 ו- 2) לערוצי הזיהוי האדומים (ערוץ מספר 1 ו- 3) כיחס בין האותות המתוקנים ברקע (BG) (eq. 3).א”ק 3 קבע את העירור הישיר של פלואורופור הקבלה δ על ידי אורך גל עירור התורם על ידי היחס בין קצב הספירה המתוקן ברקע של מדידות הכיול האדום בחלון הזמן “המהיר” (עירור על ידי לייזר ירוק) לשיעור הספירה המתוקן ברקע בחלון הזמן “עיכוב” (עירור על ידי לייזר אדום) (eq. 4).א”ק 4 חשב את הבהירות המולקולרית B של הפלורופורים הירוקים והאדומים (eq. 5a-b) בהתבסס על שיעורי הספירה המתוקנים ברקע ומספר המולקולות המתקבלות בפוקוס, N, מהתאה של דיפוזיה תלת-ממדית (eq. 1):א”ק 5אא”ק 5ב התאם הן ל-GP והן ל- ACFrd והן ל- CCFPIE של ה- DNA בעל התווית הכפולה לדגם דיפוזיה תלת-ממדית (eq. 1). שמור על גורמי הצורה המתקבלים, s ירוק ואדום,קבוע עבור ACFgp ו- ACFrd, בהתאמה. גורם הצורה עבור עוגתCCF, sPIE, נמצא בדרך כלל בין שני ערכים אלה.הערה: בהגדרה אידיאלית, הן Veff,ירוק ו- Veff, אדום יהיה באותו גודל וחפיפה מושלמת. קבע את המשרעת בזמן מתאם אפס, G0(tc), בהתבסס על הערכים שנמצאו של המספר הנראה לעין של מולקולות במוקד (Nירוק, Nאדום ו- NPIE). חשב את יחס המשרעת rGR ו- rRG עבור מדגם עם 100% דיפוזיה משותפת של פלואורופור ירוק ואדום (eq. 6). שים לב כי NPIE אינו משקף את מספר המולקולות המסומנות כפולה במוקד, אך משקף רק את 1 /G0(tc).ו- eq. 6 ניסויים בתאים חייםעבור מבנים בעלי תווית אחת, התאם את דוגמאות התא לדגם המתאים. עבור קולטן הממברנה המוצג, דיפוזיה מתרחשת בצורה דו-מודולית עם זמן דיפוזיה קצר וארוך. בנוסף, יש לקחת בחשבון את הפוטופיזיקה והמצמוץ של הפלורופורים: א”ק 7כאן, td1 ו- td2 הם שני זמני הדיפוזיה הנדרשים, ו- 1 הוא השבר של זמן הדיפוזיה הראשון.הערה: בניגוד למדידות הכיול, שבהן הצבעים החופשיים וגדילי ה- DNA מפוזרים בחופשיות לכל הכיוונים, קולטן הממברנה מראה דיפוזיה דו-ממדית בלבד לאורך קרום התא. הבדל זה בין דיפוזיה תלת-ממדית לדו-ממדית משתקף על-ידי מונח הדיפוזיה שהשתנה (השווה eq. 1), כאשר tD במקרה הדו-ממדי אינו תלוי במקדם הצורה של רכיב אמצעי האחסון הקונפוקלי. חשב את הריכוז c של חלבונים ירוקים או אדומים המסומנים ב- N ו- Veff בהתאמה באמצעות מתמטיקה בסיסית (eq. 8):א”ק 8איפה NA = המספר של אבוגאדרו עבור תווית SNAP של N-terminal ו- eGFP תאי, התאם לשני התיקון האוטומטי (ACFgp ו- ACFrd) של המדגם בעל התווית הכפולה באמצעות אותו דגם כמו עבור המבנים בעלי התווית הבודדת עבור ה- ACFs (eq. 7) ו- CCF PIE באמצעות מודל דיפוזיה דו-מודולרית (eq. 9):א”ק 9הערה: עבור תיאור גלובלי של המערכת, כל שלוש העקומות צריכות להיות מתאימות במשותף: מונח הדיפוזיה זהה לכל שלוש העקומות וההבדל היחיד הוא מונח ההרפיה עבור CCFPIE. כמו פוטופיזיקה של שני פלואורופורים הוא בדרך כלל לא קשור, אין מונח מתאם נדרש. היעדר תנאי הרפיה זה גורם ל- CCF PIE שטוח בזמני מתאם קצרים. עם זאת, הצלבה ועריכה ישירה של המקבל עקב פלואורופור התורם עשוי להראות משרעת חיובית כוזבת ויש לבדוק בקפידה לשימוש מדידות הכיול. חשב את הריכוז c של חלבונים ירוקים או אדומים המסומנים בתווית מ- N ו- Veff בהתאמה באמצעות משוואה 8. הערכת השבר או הריכוז, cGR או cRG, של אינטראקציה עם חלבונים בעלי תווית ירוקה ואדומה מדגימות התא באמצעות גורמי התיקון המתקבלים מדגימות ה- DNA, יחסי המשרעת rGR ו- rRG של דגימת התא והריכוזים שהושגו בהתאמה (eq. 10). ו- eq. 10 עבור תווית SNAP של מסוף C ו- eGFP תאי, התאם לשני תיקון אוטומטי (ACFgp ו- ACFrd) של מדגם FRET כדוגמאות בעלות תווית אחת (משוואה 7) ואת ה- CCFFRET למודל דיפוזיה דו-מודולרית המכיל מונח אנטי-מתאם (משוואה 11) כ”ק 11כאשרf משקף את המשרעת של האנטי-מתאם הכולל ו R ו- tR זמן משרעת ורגיעה בהתאמה.הערה: במקרה של שינויים פלואורסצנטיים אנטי בקורלציה עקב FRET, ייתכן שיידרש מונח אחד או מספר מונחים נגד מתאם (eq. 11), וכתוצאה מכך “טבילה” של CCFFRET בזמני מתאם נמוכים במקביל לעלייה בשני התיקון האוטומטי (ACFgp ו- ACFrd). עם זאת, שים לב כי פוטופיזיקה כגון מצמוץ שלישייה עשוי להסוות את המונח אנטי מתאם על ידי שיכוך את FRET המושרה אנטימתאם. ניתוח משותף בתוספת שיטות FCS מסוננות עשוי לעזור לחשוף את המונח נגד מתאם. בנוסף, יש לא לכלולחפציםטכניים הנובעים מזמנים מתים בספירת האלקטרוניקה בטווח הננו-שניות . הליך מפורט יותר שלב אחר שלב על איך לבצע את הניתוח ב ChiSurf28 ותבניות לחישוב של נפח קונפוקלי או בהירות מולקולרית מסופקים על מאגר Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) וכקבצים משלימים (תוספת הערה 4 ופתק משלים 6). בנוסף, ניתן למצוא שם את קבצי הפיתון-סקריפטים לייצוא אצווה של נתונים שנרכשו עם תוכנת Symphotime בפורמט .ptu.

Representative Results

תוצאות מופתיות של הכיול ומדידות תאים חיים נדונות להלן. בנוסף, ההשפעה של FRET על עקומות המתאם הצולב מודגמת על סמך נתונים מדומים לצד ההשפעה של חלבון-חלבון אינטראקציה הגדלת משרעת CCFPIE. ייצוא נתוני FCS מבוססי עוגהבניסויי PIE, הנתונים נאספים במצב זמן שנפתר בזמן (TTTR)29,30. איור 1B מציג את זמן ההגעה הפוטוני היסטוגרמה של מדידת PIE של גדיל DNA בעל תווית כפולה על ההתקנההמתוארת (תוספת הערה 1). לתוכנית ההתקנה יש ארבעה ערוצי זיהוי. פליטת הפלואורסצנטיות מפוצלת תחילה על ידי קיטוב בכיווני “S” ו- “P” (בהתייחסו למישור הניצב והמקביל שבו השדה החשמלי של גל אור מתנדנד). שנית, כל כיוון קיטוב מפוצל לשני ערוצי צבע (ירוק, אדום) לפני הזיהוי, וכתוצאה מכך ארבעה ערוצים (S-ירוק, S-אדום, P-ירוק, P-אדום). בחלון הזמן “המהיר”, הפלורופור הירוק מתרגש, והאות מזוהה הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים עקב FRET. בחלון זמן ההשהיה, רק פלואורופור אדום (בערוץ האדום) גלוי. בהתבסס על ערוצי האיתור וחלונות הזמן “התפוגג”, ניתן להשיג לפחות חמש עקומות מתאם שונות (3 עקומות תיקון אוטומטי (ACFs) ו-2 עקומות מתאם צולב (CCFs)) (איור 1C-D): (1) אות ירוק בחלון הזמן של הבקשה(ACFgp),(2) אות אדום בחלון הזמן הבקשה (במקרה של FRET, ACFrp), ו- (3) אות אדום בחלון זמן ההשהיה(ACFrd). ACFs אלה מדווחים על ניידות חלבון, פוטופיזיקה (למשל, מצמוץ שלישייה) ושינויי בהירות אחרים הקשורים בזמן פלואורופור (למשל, עקב FRET). (4) CCFPIE מבוסס PIE מבוסס PIE של האות הירוק בחלון הזמן המהיר עם האות האדום בחלון זמן ההשהיה מאפשר לקבוע את שבריר ההפצה המשותפת של הפלואורופור הירוק והאדום16. (5) CCFFRET מבוסס FRET מבוסס FRET של הירוק עם האות האדום בחלון הזמן המהיר קשור לשינויי בהירות הנגרמים על-ידי FRET, ללא תיקון באותות הירוק והאדום31,32,33. איור 1: ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות מבוססת פלואורסצנטיות (צלב) המבוססת על פעימות (עוגה) המבוססת על פלואורסצנטיות (צלב) (F(C)CS). (A)במולקולות בעלות תווית פלואורסצנטית של FCS מפוזרות בחופשיות בתוך ומחוץ לנפח מוקד (מוגבל עקיפה) בצורת קרן לייזר ממוקדת שגורמת לפלורסצנטיות בתוך נפח זעיר זה. תנודות העוצמה הנובעות מכך של מולקולות הנכנסות ויוצאות מהנפח מתואמות ומספקות מידע על ניידות המולקולות. (B)ב- PIE, שני קווי לייזר שונים (“בקשה” ו”עיכוב”) משמשים לרגש את המדגם המסומן בשני פלואורופורים שונים (“ירוק” ו”אדום”). הפרש הזמן בין שני פעימות העירור מותאם לתקופות החיים הפלואורסצנטיות של הפלורופורים המתאימים, כך שאחד נרקב לפני השני מתרגש. במדגם כפול התווית המוצגת, שני הפלורופורים קרובים מספיק כדי לעבור העברת אנרגיה תהודה Förster (FRET) מן פלואורופור התורם “הירוק” כדי פלואורופור “אדום” מקבל. לפיכך, פליטת פלואורסצנטיות אדומה יכולה להיות מזוהה בחלון הזמן “המהיר” עם עירור התורם הירוק. בהגדרה המשומשת (תוספת הערה 2), שני גלאים משמשים עבור כל צבע, אחד מכוון מקביל לכיוון קרן העירור (מסומן “p”) ואת השני בניצב (מסומן “s”). (C) ניתן לקבוע שלוש פונקציות שונות של תיקון אוטומטי בניסוי PIE: מתאם של אותות הערוץ הירוקים של i בחלון הזמן של הבקשה(ACFgp),ii) אותות ערוץ אדום בחלון הזמן של הבקשה (ACFrp) ו- iii) אותות ערוץ אדום בחלון זמן ההשהיה(ACFrd). (D) ניתן לקבוע שתי פונקציות מתאם צולבות שונות: iv) מתאם צולב “PIE”(CCFPIE) עם אותות ערוץ ירוק בחלון הזמן המהיר בקורלציה עם אותות הערוץ האדום בחלון ההשהיה, שבו המשרעת של עקומת זו קשורה לפיזור משותף של פלואורופורים; ו- v) המתאם הצולב “FRET” (CCFFRET) עם אותות הערוץ הירוק בחלון הזמן של הבקשה בקורלציה עם אותות הערוץ האדום באותו חלון בקשה; כאן הצורה של עקומה זו לפעמים מהר יותר מאשר דיפוזיה קשורה לשינויי עוצמת המושרה FRET. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. כיולאיור 2A-B מציג מדידת כיול של הפלורופורים הירוקים והאדומים המתפזרים בנפרד, בהתאמה. בהתבסס על התאמה עם eq. 1 ומקדם הדיפוזיה הידוע Dירוק26 ו- Dאדום27 הצורה (z0 ו- w0) והגודל (Veff) של נפח הזיהוי מחושבים באמצעות eq. 2a-c. תוצאות ההתאמה של ה- ACFgp מהפלואורופור הירוק ומ- ACFrd מהפלואורופור האדום מסוכמות באיור 2C. שני הפלואורופורים מראים קבוע זמן הרפיה נוסף של 8.6 מיקרו (18%) ו 36 מיקרו (15%), בהתאמה. הבהירות המולקולרית (eq. 5a-b) של הפלורופור הירוק והאדום מסתכמת ב-12.5 קילו-הרץ למולקולה ו-2.7 קילו-הרץ למולקולה, בהתאמה. להערכה אמינה של גודל הנפח והצורה הקונפוקליים כמו גם הבהירות המולקולרית, מומלץ לבצע 3-5 מדידות לניסויי כיול והתאמה משותפת (או גלובלית) של כל החזרות. α ההצלבה(איור 2D,eq. 3) וההערצה הישירה של מקבל על ידי δ הלייזר הירוק(איור 2E,eq. 4) עבור זוג פלואורופור זה שוכבים על ~ 15% ו ~ 38%, בהתאמה. איור 2: מדידות כיול של תקן כיול ירוק ואדום המתפזר בחופשיות. (A-B) מדידת 60 s מייצגת של 2 ננומטר ירוק (A) ומדידת תקן כיול אדום 10 ננומטר(B)המותאמת לדגם דיפוזיה תלת-ממדית כולל זמן מנוחה נוסף (eq. 1). הטבלה בחלונית (C) מציגה את תוצאות ההתאמה ואת הפרמטר הנגזר בהתבסס על eq. 2a-c ו- eq. 5a-b. *מקדמי דיפוזיה נלקחו מהספרות26,27. (ד)קביעת α ההצלבה של האות הירוק לערוצים האדומים ( כ” ק3). ספקטרום העירור של התקן הירוק מוצג בציאן, ספקטרום הפליטה בירוק. קווי לייזר העירור ב 485 ננומטר (כחול) ו 561 ננומטר (כתום) מוצגים כקווי מקווקו. תיבות ירוקות ומגנטה שקופות מציגות את טווח הפליטה שנאסף(הערה משלימה 2). (ה)קביעת העירור הישיר δ של הפלואורופור האדום על ידי לייזר 485 ננומטר (eq. 4). קוד הצבע זהה ל- (D),כתום בהיר וכהה מציגים את ספקטרום העירור והפליטה של התקן האדום, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. כדי לקבוע ולכייל את החפיפה של נפח העירור הירוק והאדום, נעשה שימוש בגדיל כפול של DNA בעל תווית כפולה (איור 3A) כמתואר לעיל. כאן, הפלורופורים מרווחים זה מזה ב-40 bp, כך שלא ניתן להתרחש FRET בין הפלורופורים הירוקים והאדומים המחוברים לקצוות הגדילים הכפולים של הדנ”א. איור 3B מציג את התיקון האוטומטי משני הפלואורופורים בירוק(ACFgp)ומגנטה(ACFrd)והמתאם של צלב PIE, CCFPIE,בציאן. שים לב כי עבור CCFPIE, האות בערוצים הירוקים בחלון הזמן של הבקשה מתואם עם האות בערוצים האדומים בחלון זמן ההשהיה16. כאן, מקדם דיפוזיה ממוצע עבור גדיל ה- DNA של D DNA = 77 מיקרומטר רבוע / s מתקבל. פרטים נוספים על החישוב ניתן למצוא בפרוטוקול שלב אחר שלב, הערה משלימה 4. ערך זה מתקבל על-ידי הוספת אמצעי האחסון המכוילים של הכרכים לזיהוי ירוק ואדום (איור 2)ושעות ההפצה המתאימות של ACFgp ו- ACFrd של גדיל ה- DNA (איור 3C) למשוואה 2a. לאחר מכן, באמצעות ערכי התיקון המתקבלים rGR ו- rRG ושימוש ב- eq. 6 מאוחר יותר, ניתן לקבוע את כמות ההשתתפות העצמית, כלומר, מולקולות בעלות תווית כפולה (או מתחמי חלבון במקרה של שיתוף פעולה של שני חלבונים שונים) מדגימות התא. איור 3: כיול נפח החפיפה הירוק-אדום באמצעות דגימת דנ”א. (A)גדיל ה- DNA המשמש לכיול נושא פלואורופור ירוק וכיול אדום, עם מרחק של 40 bp בין לבין. המרחק הבין-די גדול כדי לא לכלול FRET בין הפלורופורים. (B)מדידת 60 s מייצגת של פתרון DNA 10 ננומטרי. תיקון אוטומטי משני הפלורופורים בירוק(GPACF,תקן ירוק) ומגנטה(ACFrd, תקןאדום) וה-PIE-crosscorrelation, CCFPIE,בכחול. הטבלה בחלונית (C) מציגה את תוצאות ההתאמה המבוססות על מודל דיפוזיה תלת-ממדית כולל מונח הרפיה נוסף (eq. 1) ומקדם דיפוזיה הפרמטר הנגזר של DNA, DDNA (eq. 2a), הגודל והצורה של נפח החפיפה (eq. 2a-c) ויחסי התיקון rGR ו- rRG (eq. 6. ). אנא שימו לב שהערכים של אמצעי האחסון הירוק והאדום (המסומנים ב*) נלקחו מההתאמה של הפלורופורים הבודדים המוצגים באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. ניסויים בתא חיבסעיף הבא, מוצג ניתוח של ניסויים בתאים חיים עבור מבנים שונים β2AR. מכיוון β2AR הוא חלבון ממברנה, הדיפוזיה שלו מוגבלת במידה רבה לפיזור דו מימדי (איור 4A) לאורך קרום התא (למעט תהליכי הובלה או מיחזור אל הממברנה או ממנה) 2. עם ההגבלה על דיפוזיה 2D גורם הצורה s = z0/w0 ב- eq. 1 הופך מיושן וכתוצאה מכך מודל דיפוזיה פשוטה (eq. 9). מבנים בעלי תווית אחת: β2AR-IL3-eGFP ו- NT-SNAP-β2ARאיור 4 מציג מדידות מופתיות של המבנה בעל התווית הבודדת β2AR-IL3-eGFP (איור 4B),שבו eGFP מוכנס ללולאה התאית 3, ואת המבנה NT-SNAP-β2AR (איור 4C),שבו תג SNAP מצומד ל- N-terminus של β2AR. תג SNAP מסומן במצע משטח SNAP אטום לממברנה. העקומות הייצוגיות מציגות את הממוצע של 4-6 מדידות חוזרות עם זמני רכישה של 120 – 200 s כל אחד. התיקון האוטומטי המתאים ACFgp ו- ACF rd של אות eGFP ו- SNAP מותאמים לדגם דיפוזיה דו-ממדי דו-ממדי (eq. 9). במונחים של דינמיקה מהירה, eGFP מראה רק את השלישייה הצפויה מהבהבת ב tR1 ~ 9 μs בעוד אות SNAP דורש שתי פעמים הרפיה, אחד בזמן מצמוץ שלישייה טיפוסי של tR1 ~ 5 μs והשני ב tR2 ~ 180 μs. הבהירות המולקולרית של הפלורופורים בתאים חיים היא 0.8 קילו-הרץ (eGFP) ו-1.7 קילו-הרץ (SNAP) למולקולה בתנאי העירור הנתונים (eqs. 5a-b). הריכוז של β2מבני AR המשולבים בקרום התא צריך להיות בטווח ננו-טוחנת והוא יכול להיקבע על ידי המספר הממוצע של מולקולות (eq. 9, איור 4C) ואת גודל הנפח הקונפוקלי המתאים עבור הערוץ הירוק והאדום (איור 2) באמצעות eq. 8. איור 4: מדידה מייצגת של מבנים בעלי תווית אחת. (A)במחקר זה, קולטן הממברנה β2AR שימש כדוגמה. בניגוד לפלורופורים ולגדיל ה- DNA המשמש לכיול, אשר יכולים לצוף בחופשיות דרך נפח הזיהוי, חלבוני הממברנה מפוזרים בעיקר לרוחב לאורך הממברנה, המתוארת כדיפוזיה דו-ממדית. (B, D) ACFgp ו- ACFrd של מבנים בעלי תווית אחת β2AR-IL3-eGFP (B) ו- NT-SNAP-β2AR(D). מוצג הממוצע של 4-6 מדידות כל שנאספו עבור 120 – 200 s. הטבלה בחלונית (C) מציגה את תוצאות ההתאמה של הנתונים למודל הדיפוזיה הדו-ממדי הדו-ממדי הדו-ממדית הדו-ממדית הכולל מונחי הרפיה נוספים (eq. 7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מבנה בעל תווית כפולה: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFPבמבנה בעל התווית הכפולה NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (NT-SNAP קצר), eGFP מוכנס ללולאה התאית 3, ותג SNAP מצומד ל- N-terminus של β2AR (איור 5A). בתצורה זו, ה- eGFP נמצא בצד הפנימי של הממברנה וה- SNAP בצד החיצוני עם מרחקים גדולים מדי עבור FRET. במקרה אידיאלי, מבנה זה יראה 100% דיפוזיה משותפת של פלואורופור ירוק ואדום, ואין אות FRET. איור 5B-D מציג שתי מדידות של NT-SNAP בשני תאים בשני ימי מדידה שונים. התאמת ה-GP של ACF ו- ACFשל המדידה “הטובה יותר” המוצגת באיור 5B עם eq. 7 ו- CCF PIE עם eq. 9, חושפת 50- 60 מולקולות בפוקוס עבור GP ACF ו- ACFrd, ואילו אפליקצייתN, ובכך 1/G0(tc) ~ 114 עבור עוגת CCF (איור 5C ). הריכוז של קולטנים מסומנים טמון בטווח ~ 100 nM כפי שנקבע עם eq. 8. כדי לקבוע את הריכוז הממוצע של מולקולות בעלות תוויות כפולות, ראשית, מחושב היחס בין G0(tc) (המיוצג על-ידי 1/N(אפליקציה)של CCFPIE ל- ACFgp ו- ACFrd, בהתאמה , (eq. 6). לאחר מכן, ערכים אלה, rGRcell= 0.43ו- r RGcell = 0.53 מושוים לערכים המתקבלים ממדידת ה- DNA (rGR, DNA= 0.51 ו- rRG, DNA = 0.79 ביום מדידה זה). באמצעות כלל הפרופורציות, rGRcell= 0.43 מ- ACFgp של אות eGFP משקף לשבריר של דיפוזיה משותפת (rGRcell/rGR, DNA) של 0.84, כאשר עבור המקרה השני של ACFrd של אות המצע SNAP, ערך זה מסתכם 0.67. הריכוז הממוצע של מבנה NT-SNAP בעל התווית הכפולה יכול סוף סוף להיות מחושב בהתבסס על eq. 10. לעומת זאת, במדידה המוצגת באיור 5D מיום אחר, ריכוז הקולטנים נמוך למדי והנתונים רועשים מאוד כך שטווח ההתאמה מוגבל עד ~ 10 μs. בנוסף, רק כמות נמוכה של דיפוזיה משותפת נצפתה (15 – 26%). איור 5: מבנה NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP עם תווית כפולה. (A)במבנה בעל התווית הכפולה, ה- eGFP נוסף ללולאה התאית 3 ולתג SNAP המצורף ל- N-terminus של β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd ו- CCF PIE של שתי מדידות של המבנה בעל התווית הכפולה. הנתונים מתאימים למודל דיפוזיה דו-ממדי דו-ממדי דו-ממדי (eq. 9, CCFPIE) וכולל תנאי הרפיה נוספים (eq. 7, ACFgp ו- ACFrd). הטבלה בחלונית (C) מציגה את תוצאות ההתאמה ואת ריכוז הפרמטר הנגזר (eq. 8), היחס בין משרעת המתאם בזמן מתאם אפס (G 0 (tc)) ואת השבר שלמולקולותמפזר משותף (eq. 10). שים לב כי המדידות נרכשו בימים שונים, ולכן גורם שונה במקצת עבור תיקון משרעת שימשו (B: rGR, DNA = 0.51 ו r RG, DNA = 0.79; D: rGR, DNA = 0.51 ו r RG, DNA = 0.56). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מבנה בעל תווית כפולה העובר FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAPבמבנה בעל התווית הכפולה β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(איור 6A),ה- eGFP נוסף ללולאה התאית 3 זהה למבנה NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP עם תג SNAP המצורף ל- C-terminus. כאן, שתי התוויות נמצאות באותו צד של קרום הפלזמה של התאים, כך שהפלואורופורים נמצאים בסביבה קרובה, כך ש- FRET מתרחש כפי שצוין על ידי אורך החיים של eGFP מרווה(הערה משלימה 5). בהתחשב בגמישות של אזורי חלבון לא מובנים יחסית כמו C-terminus34 ולפחות שני קונפורמציות חלבון שונות של GPCRs35, “FRET גבוה” (HF) או “FRET נמוך” (LF), שינויים דינמיים ביעילות FRET עקב שינויים במרחק eGFP-SNAP ניתן לראות ולזוהה על ידי מונח anticorrelation ב- CCFFRET (עקומת כתום באיור 6B ). תנודות FRET הוכחו להיות anticorrelated כמו הקולטן יכול להיות רק במצב אחד בכל פעם, HF או LF. התאמה משותפת (או גלובלית) של כל חמש עקומות המתאם(איור 6B)חושפת ~ 70% מהמולקולות המתפזרות באיטיות ב- ~ 100 אלפיות שניים בעוד השאר מפוזרים עם ~ 1 ms. כל ההקלות האוטומטיות ו- CCFFRET מציגות תנאי הרפיה ב- 37 מיקרו ו- 3 מיקרו; מתאמים אלה הנשלטים על ידי אות אדום(ACFrp, ACFrd ו- CCFFRET)מראים רכיב איטי נוסף ~ 50 ms (איור 6C). שינויים הנגרמים על ידי FRET על FRET CCF בתנאים שונים (איור 6D) מוצגים על ידי סדרה של סימולציות של מערכת דו-מצבית עם זמן תנודה של 70 μs בין מצבי LF ו- HF. בעת המעבר מה- LF למצב HF, נצפים שינויים באות נוגד התיקון בחלון הזמן של הבקשה: האות הירוק פוחת והאות האדום עולה (להיפך עבור HF -> LF). אם מיתוג HF-LF מתרחשת בצירי זמן מהר יותר מזמן הדיפוזיה, במילים אחרות במהלך זמן המגורים של המולקולה במוקד, ניתן לגזור את הקצב מ anticorrelation ב- CCFFRET6,31,36. שים לב כי תהליכים דינמיים איטיים יותר מזמן הדיפוזיה לא ניתן לצפות ב- FCS. בהדגמה זו, הונחו שני תרחישי FRET שונים, המראים שינוי מתון או מקסימלי ביעילות FRET בין שתי המדינות. הסימולציות בוצעו באמצעות Burbulator37 ולשקול היעדרות או נוכחות של שלישייה מצמוץ וכמות הולכת וגדלה של צולב תורם לתוך הערוצים האדומים. מונח הדיפוזיה עוצב כהפצה דו-מודולית עם 30% ממולקולות ההפצה המהירה ב- tD1 = 1 ms ושאר המולקולות המתפזרות לאט עם tD2 = 100 אלפיות שנייה. בסך הכל, 107 פוטונים היו מדומים בנפח בצורת גאוס תלת-ממדי עם w0 = 0.5 מיקרומטר ו- z0 = 1.5 מיקרומטר, גודל תיבה של 20 ו- NFCS = 0.01. איור 6E-F מציג את תוצאות הסימולציה עבור CCFFRET המתון(איור 6E)וניגודיות FRET מקסימלית (איור 6F) בהיעדר (קווים מוצקים) ונוכחות של מצמוץ שלישייה (קווים מקווקווים). ניתן לראות בקלות את האנטי-מתאם המושרה על ידי FRET באיור 6F. אפקט ה”שיכוך” עם הוספת מצב שלישייה נוסף מפחית את משרעת המתאם (איור 6E-F)38,39. איור 6: הדמיה של מדגם בעל תוויות כפולות המציגות FRET דינמי. (A)עם תווית כפולה β2AR עם eGFP שהוכנס ללולאה התאית 3 ותג SNAP של מסוף C. שני הפלואורופורים קרובים מספיק כדי לעבור FRET ולהראות שינויים ביעילות FRET אם הקולטן עובר דינמיקה של חלבונים. (B)תיקון אוטומטי (GPACF, ACFrp ו- ACFrd, להתאים עם eq. 7) ועקומות מתאם צולב (CCFFRET (eq. 7) ו- CCFPIE (eq. 9)) של מדידה לדוגמה. טבלה בחלונית (C) מציגה את תוצאות ההתאמה. (D-F) כדי להראות את ההשפעה של פרמטר ניסיוני על המונח הצפוי, FRET-induced anticorrelation, בוצעו 12 סימולציות, שבהן השינוי ביעילות FRET (קטן או גדול), כמות שונה של צולב תורם לערוצי הקבלה (0%, 1% או 10%) והיעדר ונוכחות של מצמוץ שלישייה עוצבו. שבר שיווי המשקל של שתי מדינות FRET הונח ל 50:50 ושערים החליפין שלהם הותאמו כך זמן הרפיה המתקבל tR = 70 μs. פרטים נוספים על הסימולציות רואים בטקסט. (E) CCFFRET של תוצאות הסימולציה עם ניגוד FRET מתון ובהיעדר crosstalk (כתום כהה), 1% crosstalk (כתום) ו 10% crosstalk (כתום בהיר). קווים מוצקים מראים תוצאות בהיעדר שלישייה, קווים מקווקווים בנוכחות שלישייה. (F) CCFFRET של תוצאות הסימולציה עם ניגודיות FRET מקסימלית. קוד הצבע זהה ל- (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. עם זאת, בסימולציה הדומה ביותר לתנאי הניסוי (α = 10%, 15% מצמוץ שלישייה וניגודיות FRET מתונה, קו צהוב מקווקו באיור 6E), המונח נגד שחיתות כמעט הצטמצם. איור 7 מציג את התוצאה של ניתוח נתונים מדומים אלה באמצעות המידע המקודד בהיסטוגרמה של זמן ההגעה הפוטונית (כלומר, אורך החיים של הפלואורסצנטיות) באמצעות ספקטרוסקופיית קורלציה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLCS)17,19 או FCS מסונן מינים (fFCS)18. כאן, אורך החיים של הפלואורסצנטיות של מינים ידועים של HF ו- LF (איור 7A) משמשים ליצירת משקולות או “מסננים”(איור 7B)המיושמים במהלך הליך המתאם. בעקומות מינים-אוטומטיים והצלבה(איור 7C-D)ניתן להבחין בבירור באנטי-חיתות. איור 7: FCS המסונן לכל החיים יכול לעזור לחשוף את התנודות מבוססות דינמיקת החלבון ביעילות FRET בדגימות עם צלב גבוה, מצמוץ שלישייה משמעותי או תכונות פוטופיזיות או ניסיוניות אחרות המסתירות את האנטי-שחיתות הנגרמת על-ידי FRET ב- CCFFRET. כאן, הגישה מוצגת למופת עבור הנתונים המוצגים באיור 6E עבור הסימולציה המכילה 10% צולבת ו-5% מצמוץ שלישייה. (A)דפוסי דעיכה של עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת עבור שני המינים FRET (אור וירוק כהה עבור FRET גבוה ונמוך, בהתאמה) ואת IRF (אפור). התבנית עבור ערוץ הזיהוי המקביל מוצגת בקווים מלאים, קווים מקווקווים עבור ערוץ הזיהוי הניצב. (B)פונקציית ההקללה או “המסנן” נוצרו בהתבסס על התבניות המוצגות ב- (A),קוד הצבע זהה ל -A). שים לב כי רק האות בערוצי הזיהוי הירוקים, ולכן מרווה התורם המושרה FRET, נחשב כאן. (C)מתקבלים ארבעה מתאמים סלקטיביים מינים שונים: תיקון אוטומטי של מינים של מצב FRET נמוך(sACFLF-LF,ירוק כהה) ומצב FRET גבוה(sACFHF-HF,ירוק בהיר), ושני מינים-crosscorrelations בין FRET נמוך למצב FRET גבוה(sCCFLF-HF,כתום כהה) ולהיפך(SCCFHF-LF כתום). ה-sCCF מראה בבירור את האנטי-שחיתות בטווח ה-μs. קווים שחורים מקווקווים מראים את ההתקפים. sACF היו בכושר עם eq. 9 ו sCCF עם eq. 11. טבלה בחלונית (D) מציגה את תוצאות ההתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. משרעת CCFPIE לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)לבסוף, מקרה שימוש נפוץ עבור FCS מבוסס PIE בתאים חיים הוא לחקור את האינטראקציה בין שני חלבונים שונים. כאן, הפרמטר קריאה החוצה הוא משרעת של CCFPIE, או ליתר דיוק את היחס של משרעת תיקון אוטומטי ACFgp ו- ACFrd למשרעת של CCFPIE. כדי להראות את ההשפעה של דיפוזיה משותפת גוברת על CCFPIE, סימולציות בוצעו בהתבסס על שני מבנים בעלי תווית אחת, β2AR-IL3-eGFP ו NT-SNAP-β2AR (איור 8A). איור 8B מראה כיצד המשרעת של CCFPIE גדלה כאשר שבר המולקולות המפיצות משתנה מ-0% ל-100%. שים לב כי צליבה של 1% של אות ירוק לתוך הערוצים האדומים בחלון זמן ההשהיה נוספה עם רכיבי דיפוזיה אחרת מודלים כפי שמוצג לעיל. איור 8: ניתן להשתמש ב- CCF PIE כדי לחקור את האינטראקציה של שני חלבונים. (A)כאן, מחקר שיתוף פעולה של β2AR-IL3-eGFP עם NT-SNAP-β2AR (נושא תווית SNAP “אדומה”) היה מדומה. (B)עבור כמות הולכת וגדלה של מולקולות מפזרות (0% (כחול כהה) -> 100% (כחול בהיר)) המשרעת G(tc) מגבירה. מונח הדיפוזיה עוצב שוב כהפצה דו-מודולית עם 30% ממולקולות ההפצה המהירה ב- tD1 = 1 ms ושאר המולקולות המתפזרות לאט עם tD2 = 100 אלפיות שנייה. בנוסף, נוספה 1% של אות ירוק לחלון זמן ההשהיה האדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. סמל משמעות (יחידה משותפת) α צולב של פלואורופור ירוק לאחר עירור ירוק לתוך ערוצי הזיהוי האדומים (%) 1 שבר של רכיב דיפוזיה הראשון במודל דיפוזיה דו-מודולית של קולטני ממברנה af משרעת מוחלטת של המונח נגד שחיתות R משרעת של פוטופיזיקה / שלישייה מהבהבת b קו בסיס / היסט של עקומת מתאם B בהירות מולקולרית של פלואורופור (קילו)סופרת למולקולה ושנית) ב”ג רקע (למשל מדגם הפניה מתאים: ddH2O, מאגר, תא לא נגוע וכו ‘) c ריכוז CR קצב ספירה (KHz או (קילו-) סופר לשניה) δ עירור ישיר של פלואורופור אדום לאחר עירור ירוק (%) D מקדם דיפוזיה (μm²/s) G(tc) פונקציית מתאם N מספר המולקולות במוקד NA המספר של אבוגדרו (6.022*1023 מול-1) rGR, rRG יחס משרעת של פונקציית תיקון אוטומטי ירוק או אדום לפונקציה מבוססת PIE של מתאם צולב s גורם צורה של רכיב נפח קונפוקלי tc זמן מתאם (בדרך כלל באלפית שניה) tD זמן דיפוזיה (בדרך כלל באלפיות שניה או מיקרו-שנייה) tR זמן הרפיה של פוטופיזיקה (בדרך כלל במיקרו שנייה) tT זמן הרפיה של שלישייה מצמוץ (בדרך כלל במיקרו שנייה) w0 חצי רוחב של רכיב נפח קונפוקלי (מיקרומטר) z0 חצי גובה של רכיב נפח קונפוקלי (מיקרומטר) טבלה 1: רשימת משתנים וקיצורים. לשימוש בסמלים והגדרה בניסויי פלואורסצנטיות ו- FRET, מומלץ הקווים המנחים של קהילת FRET40. קבצים משלימים: SuppNote1_Coverslip ניקוי.docx אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. SuppNote2_Confocal ההתקנה.docx נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. SuppNote3_Data לייצא.docx אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. SuppNote4_FCCS ניתוח כיול באמצעות ChiSurf.docx אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. SuppNote5_Fluorescence היסטוגרמה לכל החיים.docx אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. S6_Scripts.zip אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. S7_Excel_templates.zip אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

טכניקות FCS ב- GPCRs מאפשרות להעריך את הניידות והאינטראקציות של קולטנים בתוך תאים חיים. היתרון של טכניקת FRET-FCS הוא, יחד עם ניידות, הדינמיקה הקונפורמציה של GPCRs ניתן לחקור. עם זאת, ביצוע FRET-FCS בתאים חיים הוא מאתגר ודורש תאים המציגים ביטוי נמוך (או מתון ביותר) של חלבון בעל תווית פלואורסצנטית של עניין, התקנה מכוילת היטב וצינור טוב לנתח נתונים. כאן, ראשית, הנקודות הקריטיות בהכנת המדגם ובהליך הניסיוני נדונות לגבי נקודות המבט הביולוגיות, הספקטרוסקופיות והטכניות.

צעדים ניסיוניים קריטיים כוללים מזעור הרקע וההשפעה האוטומטית (באמצעות כיסויים מנוקים בהרחבה ומדיה חופשית פנול-אדומה), אופטימיזציה של תנאי transfection (למשל, כמות ה- DNA plasmid וזמן לאחר transfection) כדי להשיג רמות ביטוי נמוכות ותיוג יעיל. כמובן, זה גם חיוני כדי להבטיח כי הפונקציה של חלבון שכותרתו אינה נפגעת. לכן, בניסויים בתא חי, ההחלטה על אסטרטגיית התיוג ואת מיקום התווית נעשית לעתים קרובות לטובת חלבונים פלואורסצנטיים או תג SNAP / CLIP המצורפים N- או C-terminus גמיש42,43. אסטרטגיות תיוג חלופיות כמו החדרת חומצת אמינו לא טבעית עם שרשרת צד תגובתית לתיוג עם פלואורופור אורגני התפתחו בשנים האחרונות44.

עבור PIE-FCS בצבע כפול, שבו רק את האינטראקציה של שתי מולקולות עניין יש לחקור, פלואורופורים ניתן לבחור מתוך מגוון גדול של חלבונים פלואורסצנטיים הוקמה או מצעים SNAP / CLIP. כאן, מבחינת ספקטרוסקופיה המטרה צריכה להיות לבחור זוג כזה שרגש צולב קטן או עירור קבלה ישיר להתרחש. בנוסף, הפלורופורים שנבחרו צריכים להיות ניתנים לצילום ולהראות מעט או ללא להלבנה בתנאי הניסוי שנבחרו. מומלץ לבחור פלואורופורים בטווח הספקטרלי האדום שכן (1) הרקע האוטופלואורסצנטי מהתא מופחת ו -(2) אור העירור הוא של אורך גל ארוך יותר, ובכך פחות פוטוטוקסי14. ניתן למזער את ההלבנה באמצעות מה שמכונה “סדרת כוח” תחילה, שבה כוח הלייזר גדל צעד אחד, והבהירות המולקולרית נצפית. טווח עוצמת העירור האופטימלי טמון בטווח הליניארי של התוצאות45.

אם שתי התוויות אמורות לדווח גם על דינמיקה קונפורמציה חלבון באמצעות FRET אז הבחירה של פלואורופור זמין מוגבל יותר. כאן, יש להעריך מראש את המרחק המינימלי/מקסימלי האפשרי בין שני הפלורופורים, למשל, בהתבסס על מבנים זמינים או גודל מולקולרי, וזוג פלואורופור שנבחר עם רדיוס סביר של Förster R0 כך ש- FRET יכול להתרחש למעשה20.

כאן, eGFP ותג SNAP נבחרו לתיוג, ותג SNAP תויג עם מצע משטח תאי או בלתי חדיר לממברנה. הספקטרום דומה לזה המוצג באיור 2C-D. שילוב זה של פלואורופורים מראה צליבה גבוהה של eGFP לתוך ערוצי הזיהוי האדומים והתרגשות מקבלת ישירה של מצע SNAP על ידי עירור ירוק בחלון הזמן המהיר וגורם לאות “שקרי” משמעותי בערוצים האדומים בחלון הזמן המהיר. באופן אידיאלי, שני הערכים, דיבור צולב והתרגשות קבלה ישירה, לא יעלה על 5%5,6,38. עם זאת, עם רדיוס Förster של 57 Å, הוא מתאים באופן אידיאלי כדי לבדוק את המרחק בין התוויות β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP מבנה כפי שניתן להעריך מן החיים eGFP מרווה (הערה משלימה 5).

מבחינה טכנית, באשר לכל ניסוי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית, המכשיר צריך להיות מיושר היטב צריך להיות בעל מקורות עירור מתאימים, מסנן פליטה, גלאים רגישים. כדי למנוע חפצים מגלאי לאחר ההצמדה בציר הזמן של μs, לפחות שני גלאים של כל צבע צריכים להיות נוכחים, אשר ניתן לתאם. באלקטרוניקה מודרנית בקורלציה של ספירת פוטון יחיד, הזמן המת של כרטיס הזיהוי בטווח הזמן של ns בקושי משחק תפקיד בשל ערוצי הניתוב העצמאיים, עם זאת, ניתן לבדוק אותו כפי שהוצע על ידי Müller et al 16 בתנאי טווח הזמן של עניין טמון בטווח הזמן sub-μs / ns. בנוסף, עבור רזולוציות זמן גבוהות עוד יותר בטווח ps, יש להכפיל כל ערוץ זיהוי, כלומר, יש להשתמש בארבעה גלאים לכל צבע, כדי לעקוף גם גלאי מת כפול2,15,29,46. בעוד שניתן להעריך את משך החיים הממוצע של פלואורסצנטיות באמצעות זיהוי פלואורסצנטיות לא מקוטב, לניתוח המרחק (~הפצה) בין הפלורופורים יש לאסוף את הפליטה תלוית קיטוב. זאת בשל העובדה כי היעילות של העברת האנרגיה ב FRET מסתמך על הכיוון של שני פלואורופור. מידע מפורט יותר ניתן למצוא כאן20,28,47. לבסוף, בניסויי PIE, המרחק בין פעימת העיכוב המהירה לעיכוב הוא קריטי ויש לבחור אותו כך שעוצמת הפלואורו-קיום של הפלורופורים דעכה במידה רבה (איור 1B). כלל נפוץ הוא למקם את שני הפולסים פי 5 מאורך החיים של הפלואורסצנטיות בנפרד, כלומר עבור eGFP עם אורך חיים פלואורסצנטי של 2.5 ns המרחק צריך להיות 12.5 ns לכל הפחות22.

לאחר פירוט כל השיקולים של ההליך הניסיוני, הנתונים וניתוחו נדונים ביתר פירוט. כפי שצוין בסעיף הפרוטוקול, יש לבדוק את יישור ההתקנה מדי יום, כולל ניתוח מדידות הכיול. הנתונים המוצגים באיור 2A-C.g. מציגים רכיב הרפיה נוסף בטווח של 8-40 מיקרו. מהבהב שלישייה טיפוסי של פלואורופור כיול ירוק ידוע להתרחש בטווח 2-10 μs13,15,48. רכיב ההרפיה האיטי הנדרש בכל העקומות של דגימת ה- DNA (איור 3C), איטי מדי למצמוץ שלישייה בפועל, עשוי לנבוע מאינטראקציות של ה- DNA עם הפלורופורים39. עם זאת, רכיב זה לא היה צפוי ב-CCF PIE, וסביר להניח שהוא נובע משיורי צולבים. לכן, מומלץ מאוד לבצע את הניתוח של דגימות הכיול ישירות לפני שתמשיך לניסויים בתאים כדי לשפוט את איכות היישור של היום.

הכיול הנכון של נפח החפיפה הקונפוקלי דורש דגימה עם 100% דיפוזיה משותפת של התווית הירוקה והאדומה. כאן, נעשה שימוש בדנ”א כפול תקוע כפול. שני גדילי ה- DNA יכולים להיות מותאמים כך שיהיו הפלורופורים הרצויים במרחק הנדרש זה מזה. את הגדילים המעוצבים ניתן לטלטל בתפוקה גבוהה. עם זאת, תרגול מעבדה טובה מייעץ לבדוק את השלמות ואת מידת התיוג של גדילי ה- DNA על ידי אלקטרופורזה ג’ל אגרוז ומדידת ספקטרום הספיגה. כמו כן, התשואה של ההרכבה הכפולה יש לבדוק כמו מדידת כיול זה מסתמך באופן קריטי על ההנחה כי יש 100% דיפוזיה משותפת של הירוק עם התווית האדומה. במקרה שההנחה אינה חוקית, ייתכן שיהיה צורך להחיל גורמיתיקון 16,22. במדידות הכיול המוצגות באיור 2 ובאיור 3, הושג נפח זיהוי של 1.4 fL ו-1.9 fL בערוץ הירוק והאדום, בהתאמה. הפרש גודל זה צפוי עבור התקנה עם נפחי עירור מוגבלים כמעט עקיפה (תוספת הערה 2). במצב זה, גודל נפח העירור משתנה עם אורך גל העירור. זה מסביר את משרעת המתאם השונה שנצפו באיור 3B. גורמי התיקון הנגזרים rGR = 0.56 ו- rRG = 0.72 נכונים עבור אי התאמה בגודל זה וחפיפה פוטנציאלית לא מושלמת של שני אמצעי האחסון המעוררים3,4.

איור 4, איור 5, איור 6ואיור 7 מציגים את זרימת העבודה של מחקר מבוסס PIE-F(C)CS שמטרתו להבין את דינמיקת החלבון הקונפורמציה. ראשית, שני המבנים המסומנים בתווית אחת β2AR-IL3-eGFP ו- NT-SNAP-β2AR משמשים כפקדים לאפיון תכונות הפלורופור בתאים בהיעדר פלואורופור אחר בהתאמה (איור 4). לאחר מכן, המבנה בעל התווית הכפולה NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP הנושא תג SNAP הפונה לחוץ התא ו- eGFP בצד הציטופלסמי משמש כפקד “100% דיפוזיה משותפת”(איור 5). המבנה האחרון, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, נושא את שני הפלורופורים בצד הציטופלסמי וקרוב מספיק זה לזה כדי לעבור FRET. כאן, שוב צפויה דיפוזיה משותפת של 100% בד בבד עם תנודות עוצמה אנטי-מתואמות באות הערוצים הירוקים והאדומים בחלון הזמן המהיר, כלומר, לאחר עירור התורם, בשל דינמיקת חלבונים המשפיעה על יעילות FRET31,32,33. דינמיקה זו עשויה להופיע כאנטי-מתאם ב- CCFFRET (איור 6-7).

כל המבנים β2AR של GPCR מראים דיפוזיה דו-מודולית על קרום התא(איור 4A). בעוד β2AR-IL3-eGFP מציג רק את השלישייה הצפויה מצמוץ(איור 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR מראה זמן מנוחה איטי נוסף(איור 5C-D). סביר להניח כי tR2 עשוי לנבוע מצע SNAP לא מאוגד. זה יכול להיות מובהר על ידי ניסויים נוספים, למשל, על ידי מדידת הדיפוזיה ואת המאפיינים פוטופיזיים של מצע SNAP בשימוש בפתרון מימי. ראוי לציין, ניסוי פשוט להבדיל בין דיפוזיה לבין זמני הרפיה הוא לשנות את חור הסיכה של ההתקנה confocal, כלומר, הגדלת נפח יעיל: בעוד זמני דיפוזיה להגדיל עם נפחים יעילים גוברים, מונחי הרפיה הם ללא שינוי13. בעת קביעת הריכוז של חלבון פלואורסצנטי (FP) בהתבסס על תוצאות ההתאמה, להיות מודעים לכך FPs באופן כללי לעבור תהליך התבגרות, שבו סוף סוף הכרומופור נוצר12. זמן התבגרות זה עשוי להיות שונה מ- FP ל- FP בנוסף לפוטופיזיקה התלויה בסביבה הכימית המקומית13,15. לכן, ריכוז החלבון בפועל נוכח במדגם שדווח על ידי FCS הוא בדרך כלל לזלזל, אשר ניתן לתקן אם השבר של FPs שאינם פלואורסצנטיים ניתן לקבוע בניסוי. לבסוף, מומלץ לבדוק את ספקטרום פלואורופור בתאים חיים כדי לתקן את הערכים עבור α δ, במידת הצורך, כמו רוב fluorophores להגיב רגיש לסביבתם13,15,48. הרקע להפחתה נקבע על ידי האות שנאסף בתאים שאינם שהודבקו. בנוסף, יש לבדוק את התיקון האוטומטי של ערוץ הצבעים האחר בהתאמה ואת ה- CCF PIE כדי להיות מסוגל לזהות אותות כוזבים (הערה משלימה 4 – איור 30).

שתי המדידות של NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (איור 5D),שבו הפלורופורים ממוקמים בצדדים שונים של הממברנה, נרכשו בימים שונים ומראה את החשיבות של סטטיסטיקה בפלואורסצנטיות של מולקולה בודדת שנפתרה בזמן. כאן, התוצאות השונות עשויות לנבוע מדרגת התיוג השונה: בתא אחד דרגת התיוג והממוצע של המדידות הביאה לרעש נמוך יחסית (איור 5B),ואילו מהתא השני ניתן היה לאסוף רק שתי מדידות (איור 5A). מעבר לאיסוף כמות מספקת של נתונים, חשוב להעריך את התוצאות בזמן, ואולי למטב את אסטרטגיית התיוג. בעת תכנון הניסויים, חשוב לזכור כי FRET הוא רגיש, אך מוגבל למרחקים של עד 10 ננומטר ו “עיוור” אחרת. במקרה שלנו, זה “עיוורון” מסומן על ידי חיים פלואורסצנטי eGFP ללא משתנה (הערה משלימה 5). במבנה Β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(איור 6A),ניתן לאתר את FRET מאורך החיים של eGFP מרווה (הערה משלימה 5). עם זאת, לא נצפתה שום מונח נגד שחיתות (איור 6B), מה שאומר ש- FRET אינו משתנה או בקנה מידה זמן איטי יותר מזמן הדיפוזיה. עד שלושה תנאי הרפיה נוספים נדרשים ב- ACFgp, ACFrp, ACFrd ו- CCFFRET (איור 6C). הרכיב האיטי ב- ACFrp, ACFrd ו- CCFFRET עשוי לנבוע מהלבנת קבלים וכמובן, משפיע על הערך המתקבל של הדיפוזיה האיטית שנמצאה בעקומות אלה (~ 350 אלפיות השנייה לעומת 117 אלפיות השנייה ב- ACFgp). tD בערוץ האדום אמור להיות מעט גדול יותר מאשר בערוץ הירוק בשל אמצעי האחסון הקונפוקליים בגודל שונה (איור 2) – אך רק על ידי גורם הדומה להפרש הגודל. זמן ההרפיה המהיר מאוד של 3 μs משקף את השלישייה מצמוץ של פלואורופורים13,15,48, ואילו זמן הרפיה איטי יותר של 37 μs עשוי להיות בגלל FRET: באופן דומה, כמו FRET גורם anticorrelation ב- CCFFRET, מתאם חיובי צפויים בתיקון האוטומטי31,32,33. הנוכחות של מונח זה כמו “חיובי” ב- CCFFRET ונוכחותו ב- ACF rd עשוי להיות מוסבר עם crosstalk גבוה ויש להבהיר עוד יותר. שים לב כי ה- CCF PIE שטוח בזמני מתאם קצרים כצפוי.

מצד שני, יש לציין כי המופע של FRET במערכת של עניין מוביל השפעות לא ליניאריות על עקומות המתאם6. הבהירות המולקולרית, למשל, של מולקולה מתרחבת לתוך משרעת המתאם בריבוע וכל מצב FRET (והמולקולות הקיימות תמיד ללא קולטן פעיל) מראה בהירות מולקולרית שונה. ואכן, FRET מקטין את הריכוז לכאורה של מולקולות ירוקות שזוהו (כלומר, מגביר משרעת GP ACF) ומספר המולקולות האדומות (שנקבעו על-ידי red-prompt) מוערך יתר עלהמידה 5. שתי ההשפעות משפיעות על כמות האינטראקציה הנגזרת הן מ- CCFFRET והן מ-CCF PIE. עם זאת, ניתוח גלובלי כפי שמוצג למשל עבור הדינמיקה התוך-עינית של Calmodulin 31,32 או Syntaxin33 יכול לחשוף את דינמיקת החלבון. כאשר מכוילים בקפידה, ניתן לחלץ את יעילות FRET הממוצעת מן משרעת CCFPIE ו- ACFיחסית 22, ואילו המדינות המגבילות עשויות להיקבע מניתוח התפלגות החיים פלואורסצנטית התורם33.

בהתחשב בעובדה שבניסויים בתאים חיים עם פלואורופורים גדולים כמו eGFP הניגודיות FRET עשויה להיות נמוכה עוד יותר מההנחה עבור הסימולציות המוצגות באיור 6 וכי העירור הישיר של המקבל לא נוסף בסימולציה, עשוי להסביר מדוע זיהוי האנטי-תקנה בניסויים בתאים חיים הוא מאתגר מאוד. חלופת ניתוח מבטיחה מסתמכת על איסוף המידע המקודד בהיסטוגרמה של זמן ההגעה הפוטונית(איור 1B)הנגישה בשל איסוף נתוני ספירת הפוטונים הבודדים המתואמים בזמן29,30. אם ניתן לבחור את אורך החיים של הפלואורסצנטיות (~דפוסים) של שני המינים (או יותר) (FRET) בתוך המדגם (איור 7A),ניתן לבחור “מסנן” או משקולות המיושמים במהלך תהליך המתאם (איור 7B)17,18,19. עקומות המתאם שהושגו כך, אינן מייצגות עוד את המתאם של ערוצי האיתור אלא את המתאם האוטומטי או המתאם בין שני מינים שונים (FRET), כך שמו שונה למינים-ACF (sACF) או למינים-CCF (sCCF). החלת גישה זו על הנתונים המדומים עם ניגודיות FRET מתונה, צליבה גבוהה ומצמוץ משולש משחזרת את המונח נגד שחיתות (איור 7C-D). עם זאת, יש לציין כי זמני הרפיה ניתן להשיג אבל היחסים עם משרעת הולך לאיבוד18. גישה זו יושמה בעבר בניסויים בתאים חיים, למשל כדי לחקור את האינטראקציה של EGFR עם היריבשלה 49 או כדי להפריד את הפלואורסצנטיות מחלבונים המחוברים לגרסאות eGFP עם אורך חיים פלואורסצנטי קצר וארוך במיוחד50.

בעוד שמדידות FRET מבוססות PIE בחלבונים מטוהרים משמשות בעיקר לחקר דינמיקת חלבונים3622, בתאים חיים היא מתמקדת בהבנת אינטראקציות חלבון-חלבון. גישה זו יושמה כדי ללמוד את הרגולציה של פעילות MAP קינאז בשמרים51 או כדי לפתור את האינטראקציה של חלבוני ממברנה עם השותף שלהם מחייב ציטוטוולי כפי שסיכם במאמר זה לאחרונה52. כאן, סיבוכים עלולים להתעורר כאשר crosstalk משמעותי של פלואורופור ירוק עדיין קיים בחלון זמן ההשהיה של הערוצים האדומים או אות אדום בערוצים הירוקים בחלון הזמן המהיר. הראשון עלול להיגרם על ידי עיכוב לא מספיק של הדופק האדום ביחס לדופק הירוק בעוד שתי ההשפעות נובעות עירור חופף מדי ספקטרום פליטה של פלואורופורים שנבחרו. מומלץ לבדוק את המבנים המסומנים בתווית אחת בזהירות ובצדק עבור משרעת CCFPIE חיובית כוזבת, במיוחד בתאים שבהם פלואורסצנטיות אוטומטית עם אורך חיים פלואורסצנטי קצר מאוד עשויה להיות גורם מסבך נוסף22.

לסיכום, לגישת FRET-FCS המתוארת כאן יש פוטנציאל גדול להבין אינטראקציות חלבון-חלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים בריכוזים פיזיולוגיים קרובים. בפרוטוקול זה, ההתמקדות הונחה על מדידות הכיול הנדרשות ועל הניתוח הכמותי הדרוש לביצוע במהלך מדידות תאים חיים. עד כאן הוצגו מדידות תאים חיים שונות בנוסף לסימולציות. הסימולציות מספקות את ההבנה הכללית כאן כפרמטר יכול להיות מגוון באופן שיטתי עם מודלים מותאמים אישית המתארים את הניידות הספציפית ואת המאפיינים הפוטו-פיזיים של הנתונים המתאימים. הניתוח בוצע באמצעות כלי תוכנה בקוד פתוח עם פרוטוקול שלב אחר שלב נרחב ותבניות קלות להתאמה. לבסוף, ההתקדמות הטכנית, ולכן הזמינות של מערכות PIE-FCS יציבות מוכנות לקנייה יחד עם התפשטות של תוכנת קוד פתוח לניתוח נתונים יהפכו טכניקה זו לנגישה יותר ויותר לקהילת מחקר גדולה יותר כדי בסופו של דבר לפענח אינטראקציה בין חלבונים ודינמיקה בתאים חיים עם הרגישות הגבוהה ביותר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (SFB / TR 240, מספר הפרויקט 374031971, פרויקט INF) ל J.B ו K.G.H.

אנו מודים למרכז רודולף וירכו על תמיכה כספית והדמיה פלואורסצנטית של יחידת הליבה עבור תמיכה טכנית. בנוסף, אנו מודים לאשוין בלקרישאנן על קריאת הוכחות יסודית.

Materials

1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) — Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA — tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) — Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany — Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany — Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS–friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L., Lakowicz, J. R. . Topics in Fluorescence Spectroscopy. , 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

Fluorescence Correlation SpectroscopyCross-correlation SpectroscopyFRETG Protein-coupled ReceptorsBeta-2 Adrenergic ReceptorsSphingolipid ReceptorsProtein-protein InteractionProtein DynamicsLive CellsCell CultureTransfectionSNAP-tagFluorescence AnisotropyTranslational DiffusionRotational Diffusion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image