Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Katherina Hemmen; Susobhan Choudhury; Mike Friedrich; Johannes Balkenhol; Felix Knote; Martin J. Lohse; Katrin G. Heinze

doi:10.3791/62954

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Published: December 11, 2021

doi:

10.3791/62954

Katherina Hemmen*¹, Susobhan Choudhury*¹, Mike Friedrich¹, Johannes Balkenhol¹, Felix Knote¹, Martin J. Lohse², Katrin G. Heinze¹

¹Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging,Julius-Maximilian University Wuerzburg, ²Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

Summary

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Abstract

We presenteren een protocol en workflow om live cell dual-color fluorescentie cross-correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken. In dual-color FCCS, waar de fluctuaties in fluorescentie-intensiteit de dynamische “vingerafdruk” van het respectieve fluorescerende biomolecuul vertegenwoordigen, kunnen we co-diffusie of binding van de receptoren onderzoeken. FRET, met zijn hoge gevoeligheid voor moleculaire afstanden, dient als een bekende “nanoruler” om intramoleculaire veranderingen te monitoren. Samen worden conformaaire veranderingen en belangrijke parameters zoals lokale receptorconcentraties en mobiliteitsconstanten toegankelijk in cellulaire omgevingen.

Kwantitatieve fluorescentiebenaderingen zijn een uitdaging in cellen vanwege hoge geluidsniveaus en de kwetsbaarheid van het monster. Hier laten we zien hoe dit experiment moet worden uitgevoerd, inclusief de kalibratiestappen met behulp van twee kleuren gelabelde β₂-adrenerge receptor (β₂AR) gelabeld met eGFP en SNAP-tag-TAMRA. Een stapsgewijze gegevensanalyseprocedure wordt aangeboden met behulp van open-source software en sjablonen die eenvoudig kunnen worden aangepast.

Onze richtlijn stelt onderzoekers in staat om moleculaire interacties van biomoleculen in levende cellen in situ met hoge betrouwbaarheid te ontrafelen, ondanks de beperkte signaal-naar-ruisniveaus in experimenten met levende cellen. Het operationele venster van FRET en met name FCCS bij lage concentraties maakt kwantitatieve analyse bij bijna fysiologische omstandigheden mogelijk.

Introduction

Fluorescentiespectroscopie is een van de belangrijkste methoden om eiwitdynamica en eiwit-eiwitinteracties te kwantificeren met minimale verstoring in een cellulaire context. Confocale fluorescentiescorrelatiespectroscopie (FCS) is een van de krachtige methoden om moleculaire dynamica te analyseren, omdat het gevoelig is voor één molecuul, zeer selectief en compatibel met levende cellen¹. In vergelijking met andere dynamiekgerichte benaderingen heeft FCS een breder meetbaar tijdsbereik dat zich uitstrekt van ~ ns tot ~ s, met name de snelle tijdschalen die vaak ontoegankelijk zijn door op beeldvorming gebaseerde methoden. Bovendien biedt het ook ruimtelijke selectiviteit, zodat membraan-, cytoplasmatische en kernmoleculaire dynamica gemakkelijk kan worden onderscheiden ². Zo kunnen moleculair knipperen, de gemiddelde lokale concentratie en de diffusiecoëfficiënt kwantitatief worden geanalyseerd met FCS. Intermoleculaire dynamica zoals binding worden gemakkelijk toegankelijk bij het onderzoeken van co-diffusie van twee moleculaire soorten in fluorescentie cross-correlation spectroscopie (FCCS) analyse³^,⁴^,⁵ in een tweekleurige benadering.

Het belangrijkste onderliggende principe bij correlatiespectroscopie is de statistische analyse van intensiteitsfluctuaties die worden uitgezonden door fluorescerend gelabelde biomoleculen die in en uit een laserfocus diffuus zijn(figuur 1A). De resulterende auto- of kruiscorrelatiefuncties kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd door curve-aanpassing om uiteindelijk de renteconstanten af te leiden. Met andere woorden, de statistische methoden FCS en FCCS bieden geen sporen van één molecuul zoals bij het volgen van enkele deeltjes, maar een dynamisch patroon of “vingerafdruk” van een gesondeerd monster met een hoge temporele resolutie. In combinatie met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) kan intramoleculaire dynamica zoals conformatieveranderingen tegelijkertijd worden gevolgd in een gemeenschappelijke confocale opstelling⁵^,⁶. FRET onderzoekt de afstand van twee fluoroforen en wordt vaak een moleculaire “nanoruler” genoemd. Energieoverdracht vindt alleen plaats wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden (< 10 nm), het emissiespectrum van de donor aanzienlijk overlapt met het absorptiespectrum van het acceptormolecuul en de dipooloriëntatie van de donor en acceptor (voldoende) parallel is. De combinatie van FRET en FCCS biedt dus een techniek met een zeer hoge spatio-temporele resolutie. Wanneer ruimtelijke selectiviteit, gevoeligheid en live-celcompatibiliteit vereist is, heeft FRET-FCCS duidelijk voordeel ten opzichte van andere methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC)^7,Oppervlakte plasmonresonantie (SPR)⁸of nucleaire magnetische resonantie (NMR)^9,¹⁰ voor het meten van eiwitdynamica en interacties.

Ondanks de mogelijkheden en belofte van tweekleurige fluorescentie cross-correlatie spectroscopie (dc-FCCS), is het uitvoeren van dc-FCCS in levende cellen technisch uitdagend vanwege de spectrale doorbloeding of overspraak tussen de kanalen^3,^4,het verschil in de confocale volumes als gevolg van de spectraal verschillende laserlijnen^3,^4,^11,achtergrondsignaal en ruis of beperkte fotostabiliteit van de monsters¹²^, ^13,^14,¹⁵. De introductie van pulse interleaved excitation (PIE) in FCCS was een belangrijke aanpassing om de verschillende laserexcitaties tijdelijk los te koppelen voor het verminderen van de spectrale overspraak tussen de kanalen¹⁶. Andere correctiemethoden om spectrale doorbloeding^17,^18,¹⁹ en achtergrondcorrecties tegen te gaan, zijn ook goed geaccepteerd^17,^18,^19. Voor details en basisprincipes over FCS, PIE of FRET wordt de lezer verwezen naar de volgende referenties^2,^4,^6,^16,^20,^21,^22,^23,²⁴.

Hier worden alle noodzakelijke kalibratie-experimenten en analyses samen met de experimentele resultaten van een prototypische G-eiwit gekoppelde receptor, β₂-adrenerge receptor (β₂AR), voor drie verschillende scenario’s gepresenteerd: (1) enkelgelabelde moleculen met een “groene” (eGFP) of een “rode” (SNAP-tag-gebaseerde etikettering)²⁵ fluorofoor; (2) een dubbel gelabeld construct, dat een N-terminal SNAP-tag en intracellulaire eGFP (NT-SNAP) draagt [in dit geval bevinden beide labels zich op hetzelfde eiwit. Er wordt dus 100% co-diffusie verwacht]; en (3) een dubbel gelabeld monster, waarbij beide fluoroforen zich aan dezelfde kant van het celmembraan bevinden (CT-SNAP). Het draagt een C-terminal SNAP-tag en een intracellulaire eGFP. Ook hier zitten beide labels op hetzelfde eiwit met wederom 100% co-diffusie verwacht. Omdat beide labels zeer dicht bij elkaar liggen, aan dezelfde kant van het celmembraan, toont het het potentieel om FRET en anticorrelief gedrag te observeren. Alle constructies werden getransfecteerd in Chinese Hamster Ovary (CHO) cellen en later gelabeld met een rood fluorescerend substraat dat membraan-ondoordringbaar is voor de NT-SNAP-constructie en membraandoorlatend voor de CT-SNAP-constructie. Ten slotte illustreren gesimuleerde gegevens de invloed van experimentele parameters op de FRET-geïnduceerde anticorrelatie en het effect van eiwit-eiwitinteracties op de codiffusieamplitude.

Dit protocol biedt dus een complete gids voor het uitvoeren van de gecombineerde FRET-FCCS in levende cellen om eiwitdynamiek en eiwit-eiwitinteracties te begrijpen en tegelijkertijd bewust te worden van technische / fysieke artefacten, uitdagingen en mogelijke oplossingen.

Protocol

1. Experimenteel Protocol MonstervoorbereidingOPMERKING: Voer celzaaien en transfectie uit onder steriele omstandigheden. Plaats een gereinigde dekplaat per put in een 6-well kweekplaat en was drie keer met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).OPMERKING: Het reinigingsprotocol voor de coverslip wordt beschreven in aanvullende aantekening 1. Voeg aan elke put 2 ml van het volledige celkweekmedium toe dat fenolrood bevat (aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 μg / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine) en houd de plaat apart. Kweek de CHO-cellen in hetzelfde medium met fenolrood bij 37 °C en 5% CO2. Was de cellen met 5 ml PBS om de dode cellen te verwijderen. Voeg 2 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verdun de losgemaakte cellen met 8 ml medium dat fenolrood bevat en meng voorzichtig door pipetteren. Tel de cellen in een Neubauer-kamer en zaad met een dichtheid van 1,5 x 105 cellen/put in de 6-well celkweekplaat met de coverslips (bereid in stap 1.1.1-1.1.2). Laat de cellen 24 uur groeien in een incubator (37 °C, 5% CO2) om ongeveer 80% confluentie te bereiken. Verdun 2 μg van het gewenste vector-DNA (bijv. CT-SNAP of NT-SNAP) en 6 μL van het transfectiereagens in twee afzonderlijke buisjes, elk met 500 μL van het gereduceerde serummedium voor elke put en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Meng de twee oplossingen samen om het transfectiemengsel te verkrijgen en incubeer het gedurende 20 minuten bij RT. Was ondertussen de gezaaide CHO-cellen een keer met steriel PBS. Vervang de PBS door 1 ml /put fenol roodvrij medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica. Voeg de volledige 1 ml transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan elke put en incubeer de cellen een nacht bij 37 °C, in 5% CO2. Voor de etikettering van het SNAP-construct verdunt u de geschikte SNAP-substraatvoorraadoplossing in 1 ml van het medium aangevuld met 10% FBS om een eindconcentratie van 1 μM te verkrijgen. Was de getransfecteerde cellen eenmaal met PBS en voeg 1 ml per putje 1 μM SNAP-substraatoplossing toe. Incubeer de cellen gedurende 20 min bij 37 °C in 5% CO2. Was de cellen driemaal met fenolroodvrij medium en voeg 2 ml per goed fenolroodvrij medium toe. Incubeer de cellen gedurende 30 min bij 37 °C in 5% CO2. Breng de coverslips van alle monsters vervolgens over in de beeldvormingskamer en was met een beeldbuffer van 500 μL. Voeg een beeldbuffer van 500 μL toe voordat u naar de FRET-FCS-opstelling gaat. KalibratiemetingenOPMERKING: De FRET-FCS-opstelling is uitgerust met een confocale microscoopwaterobject objectief, twee laserlijnen, een Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) systeem, twee hybride fotomultiplicatorbuizen (PMT) en twee lawinefotodiodes (APD) voor fotonenverzameling en de software voor gegevensverzameling. Het is erg belangrijk om de opstelling elke keer uit te lijnen voordat de cel metingen worden uitgevoerd. De gedetailleerde beschrijving van de opstelling is te vinden in aanvullende aantekening 2. Zowel lasers als alle detectoren (twee PMT’s en twee APD’s) staan altijd AAN tijdens de metingen, omdat alle metingen onder identieke omstandigheden moeten worden uitgevoerd. Gebruik voor de kalibratiemetingen een coverslip van dezelfde partij waarop de cellen zijn gezaaid, dit vermindert de variatie in kraagringcorrectie. Voor het aanpassen van de focus, pinhole en kraagringpositie plaatst u de 2 nM groene kalibratieoplossing op een glazen afdekplaat en schakelt u de 485 nm en 560 nm laser in. Bedien laser in Pulsed Interleaved Excitation (PIE) modus16. Focus op de oplossing en pas de pinhole en kraagringpositie zodanig aan dat de hoogste telsnelheid en het kleinste confocale volume worden verkregen om de maximale moleculaire helderheid te krijgen. Herhaal dit proces voor de rode kanalen met 10 nM rode kalibratieoplossing en een mengsel van beide, de groene en rode kalibratieoplossing. Plaats de 10 nM DNA-oplossing op een glazen afdekplaat en pas de positie van de focus, het gaatje en de kraagring zodanig aan dat de kruiscorrelatie tussen de groene en rode detectiekanalen het hoogst is, d.w.z. de hoogste amplitude laat zien.OPMERKING: Stappen 1.2.1 en 1.2.4 moeten mogelijk heen en weer worden herhaald om de optimale uitlijning te vinden. Voer 3-5 metingen uit van elke kalibratieoplossing gedurende 30 s – 120 s nadat de positie van de focus, het gaatje en de kraagring optimaal zijn uitgelijnd voor de groene en rode detectiekanalen en het confocale overlapvolume. Meet een druppel ddH2O, het beeldvormingsmedium en een niet-getransfecteerde cel 3-5 keer elk gedurende 30 s – 120 s om de achtergrondtelling te bepalen. Verzamel de instrumentresponsfunctie met 3-5 metingen voor 30 s – 120 s. Dit is optioneel, maar sterk aanbevolen. Metingen van levende cellen Zoek een geschikte cel door te verlichten met de kwiklamp en te observeren door het oculair.OPMERKING: Geschikte cellen leven met de typische morfologie van de respectieve adherente cellijn. De fluorescentie van het eiwit van belang, hier een oppervlaktereceptor, is over het hele oppervlak zichtbaar. Minder heldere cellen zijn geschikter dan helderdere vanwege het betere contrast in FCS wanneer een laag aantal moleculen scherp is. Schakel beide lasers in PIE-modus in en focus op het membraan door te kijken naar de maximale tellingen per seconde.OPMERKING: Het laservermogen moet mogelijk worden verminderd voor de celmonsters (minder dan 5 μW bij objectief). Dit is afhankelijk van de gebruikte fluoroforen en de opstelling. Observeer de auto- en kruiscorrelatiecurven van de eGFP of gelabelde SNAP-tag die aan de β2AR is bevestigd in de online preview van de software voor gegevensverzameling en verzamel verschillende korte metingen (~ 2 -10) met een acquisitietijd tussen 60 -180 s.OPMERKING: Prikkel de cellen niet gedurende een lange tijd continu, omdat de fluoroforen kunnen bleken. Het hangt echter af van de helderheid van elke cel, hoe lang de metingen kunnen zijn en hoeveel metingen in totaal kunnen worden uitgevoerd. 2. Data-analyse Gegevens exporteren Exporteer de correlatiecurven G(tc) en telsnelheden, CR, van alle metingen. Zorg ervoor dat u de tijdvensters “prompt” en “delay” correct definieert en gebruik de optie “microtime gating” in de software voor gegevenscorrelatie.OPMERKING: In totaal zijn drie verschillende correlaties vereist: (1) autocorrelatie van het groene kanaal in het prompttijdvenster(ACFgp),(2) autocorrelatie van de rode kanalen in het vertragingstijdvenster(ACFrd)en ten slotte (3) de kruiscorrelatie van het groene kanaalsignaal in het prompttijdvenster met het rode kanaalsignaal in het vertragingstijdvenster(CCFPIE). De gegevensexport wordt stap voor stap weergegeven voor verschillende software in aanvullende aantekening 3. KalibratiemetingenGebruik de autocorrelatiefuncties van de groene (ACFgp) en rode (ACFrd) fluorofooroplossingen en monteer ze op een 3D-diffusiemodel met indien nodig een extra tripletterm (eq. 1) om de vorm en grootte van het confocale detectievolume voor de twee gebruikte kleurkanalen te kalibreren: eq. 1Hier is b de basislijn van de kromme, N het aantal moleculen in focus, tD de diffusietijd (in ms) en s = z0/w0 de vormfactor van het confocale volume-element. Het triplet knipperen of andere fotofysica wordt beschreven door zijn amplitude eenR en relaxatietijd tR.OPMERKING: Alle variabelen en symbolen die binnen het protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. Gebruik de bekende diffusiecoëfficiënten D voor de groene26 en rode kalibratiestandaard27 en de verkregen vormfactoren sgroen en srood om de afmetingen (breedte b0 en hoogte z0) en volume Veff van het confocale volume-element (eq. 2a-c) te bepalen.eq. 2aeq. 2beq. 2cOPMERKING: Sjablonen voor de berekening van de kalibratieparameter worden geleverd als aanvullende bestanden (S7). Bereken de spectrale overspraak α van het groene fluorescentiesignaal (verzameld in kanalen 0 en 2) in de rode detectiekanalen (kanaal nummer 1 en 3) als een verhouding van de achtergrondgecorrigeerde (BG) signalen (eq. 3).eq. 3 Bepaal de directe excitatie van de acceptorfluoofoor δ door de donorexcitatiegolflengte door de verhouding tussen de achtergrondgecorrigeerde telsnelheid van de rode kalibratiemetingen in het “prompt” -tijdvenster (excitatie door groene laser) en de achtergrondgecorrigeerde telsnelheid in het “vertragingstijdvenster” (excitatie door rode laser) (eq. 4).eq. 4 Bereken de moleculaire helderheid B van zowel de groene als de rode fluoroforen (eq. 5a-b) op basis van de achtergrondgecorrigeerde telsnelheden en het verkregen aantal moleculen in focus, N, van de 3D-diffusiefit (eq. 1):eq. 5aeq. 5b Pas zowel ACFgp als ACFrd en CCFPIE van het dubbel gelabelde DNA toe aan het 3D-diffusiemodel (eq. 1). Houd de verkregen vormfactoren, sgroen en srood,constant voor respectievelijk ACFgp en ACFrd. De vormfactor voor de CCFPIE, sPIE, ligt meestal tussen deze twee waarden in.OPMERKING: In een ideale opstelling, zowel Veff,groen als Veff, zou rood dezelfde grootte hebben en perfect overlappen. Bepaal de amplitude bij nul correlatietijd, G0(tc), op basis van de gevonden waarden van het schijnbare aantal moleculen in focus (Ngroen, Nrood en NPIE). Bereken de amplitudeverhouding rGR en rRG voor een monster met 100% codiffusie van groene en rode fluoroforen (eq. 6). Houd er rekening mee dat NPIE niet het aantal dubbel gelabelde moleculen in focus weergeeft, maar alleen de 1 /G0(tc).en eq. 6 Experimenten met levende cellenVoor constructies met één label past u de celmonsters in een geschikt model. Voor de getoonde membraanreceptor vindt diffusie plaats op een bimodale manier met een korte en een lange diffusietijd. Bovendien moeten de fotofysica en het knipperen van de fluoroforen worden overwogen: eq. 7Hier zijn td1 en td2 de twee vereiste diffusietijden en een1 is de fractie van de eerste diffusietijd.OPMERKING: In tegenstelling tot de kalibratiemetingen, waarbij de vrije kleurstoffen en DNA-strengen vrij in alle richtingen diffunderen, vertoont de membraanreceptor alleen 2D-diffusie langs de celmembranen. Dit verschil tussen 3D- en 2D-diffusie wordt weerspiegeld door de gemodificeerde diffusieterm (vergelijk eq. 1), waarbij tD in het 2D-geval niet afhankelijk is van de vormfactor s van het confocale volume-element. Bereken de concentratie c van groene of rood gelabelde eiwitten uit de respectievelijke N en Veff met behulp van elementaire wiskunde (eq. 8):eq. 8waarbij NA = Avogadro’s getal Voor N-terminal SNAP-label en intracellulaire eGFP, passen de twee autocorrelaties (ACFgp en ACFrd) van het dubbel gelabelde monster met hetzelfde model als voor de enkelvoudig gelabelde constructen voor de AFC’s (eq. 7) en de CCFPIE met behulp van een bimodale diffusiemodel (eq. 9):eq. 9OPMERKING: Voor een globale beschrijving van het systeem moeten alle drie de curven samen worden aangepast: De diffusieterm is identiek voor alle drie de curven en het enige verschil is de ontspanningsterm voor de CCFPIE. Omdat fotofysica van twee fluoroforen meestal niet gerelateerd is, is er geen correlatieterm vereist. Deze afwezigheid van ontspanningsvoorwaarden resulteert in een vlakke CCFPIE bij korte correlatietijden. Overspraak en directe excitatie van de acceptor als gevolg van de donorfluorofoor kunnen echter vals-positieve amplitudes vertonen en moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op het gebruik van de kalibratiemetingen. Bereken de concentratie c van groene of rode gelabelde eiwitten uit de respectievelijke N en Veff met behulp van vergelijking 8. Schat de fractie of concentratie, cGR of cRG, van interagerende groen en rood gelabelde eiwitten uit de celmonsters met behulp van de correctiefactoren verkregen uit de DNA-monsters, de amplitudeverhoudingen rGR en rRG van het celmonster en hun respectieve verkregen concentraties (eq. 10). en eq. 10 Voor C-terminal SNAP-label en intracellulaire eGFP, past u de twee autocorrelaties (ACFgp en ACFrd) van het FRET-monster als de enkelvoudig gelabelde monsters (vergelijking 7) en de CCFFRET toe aan een bimodaal diffusiemodel met een anticorrelatieterm (vergelijking 11) eq. 11waarbij eenf de amplitude van de totale anticorrelatie weergeeft en eenR en tR de respectievelijke amplitude en relaxatietijd.OPMERKING: In het geval van anti-gecorreleerde fluorescentieveranderingen als gevolg van FRET, kunnen een of meer anticorrelatietermen nodig zijn (eq. 11), wat resulteert in een “dip” van CCFFRET op lage correlatietijden die samenvallen met een toename van de twee autocorrelaties (ACFgp en ACFrd). Houd er echter rekening mee dat fotofysica zoals triplet knipperen de anticorrelatieterm kan maskeren door de DOOR FRET geïnduceerde anticorrelatie te dempen. Een gezamenlijke analyse aangevuld met gefilterde FCS-methoden kan helpen om de anticorrelatieterm te ontmaskeren. Bovendien moeten technische artefacten die voortkomen uit dode tijden in de telelektronica in het nanosecondenbereik worden uitgesloten16. Een meer gedetailleerde stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van de analyse in ChiSurf28 en sjablonen voor de berekening van confocale volume of moleculaire helderheid worden verstrekt op de Github-repository (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) en als aanvullende bestanden (aanvullende opmerking 4 en aanvullende opmerking 6). Bovendien zijn de python-scripts voor batch-export van gegevens verkregen met de Symphotime-software in .ptu-formaat daar te vinden.

Representative Results

Voorbeeldige resultaten van de kalibratie en live-cell metingen worden hieronder besproken. Daarnaast wordt het effect van FRET op de kruiscorrelatiecurves aangetoond op basis van gesimuleerde gegevens naast het effect van eiwit-eiwit-interactie die de CCF PIE-amplitude verhoogt. OP PIE gebaseerde FCS-gegevensexportIn PIE-experimenten worden gegevens verzameld in de time-tag time-resolved mode (TTTR)29,30. Figuur 1B toont de histogrammen van de aankomsttijd van fotonen van een PIE-meting van een dubbel gelabelde DNA-streng op de beschreven opstelling (aanvullende aantekening 1). De opstelling heeft vier detectiekanalen. De fluorescentie-emissie wordt eerst gesplitst door polarisatie in “S” en “P” richtingen (verwijzend naar het loodrechte en parallelle vlak waarin het elektrische veld van een lichtgolf oscilleert). Ten tweede wordt elke polarisatierichting vervolgens gesplitst in twee kleurkanalen (groen, rood) voordat deze wordt gedetecteerd, wat resulteert in vier kanalen (S-groen, S-rood, P-groen, P-rood). In het “prompt” tijdvenster wordt de groene fluorofoor opgewonden en wordt het signaal gedetecteerd in zowel de groene als de rode kanalen als gevolg van FRET. In het vertragingstijdvenster is alleen de rode fluorofoor (in het rode kanaal) zichtbaar. Op basis van de detectiekanalen en “prompt” versus “vertraagde” tijdvensters kunnen ten minste vijf verschillende correlatiecurven (3 autocorrelatiecurven (APF’s) en 2 kruiscorrelatiecurven (CCF’s)) worden verkregen(Figuur 1C-D):(1) groen signaal in het prompttijdvenster (ACFgp), (2) rood signaal in het prompttijdvenster (in het geval van FRET, ACFrp), en (3) rood signaal in het vertragingstijdvenster(ACFrd). Deze AFF’s rapporteren over de eiwitmobiliteit, fotofysica (bijv. Triplet knipperen) en andere tijdgecorreleerde helderheidsveranderingen in de fluoroforen (bijvoorbeeld als gevolg van FRET). (4) De op de OOB gebaseerde kruiscorrelatie CCFPIE van het groene signaal in het prompttijdvenster met het rode signaal in het vertragingstijdvenster maakt het mogelijk de fractie van codiffusie van de groene en rode fluorofoor te bepalen16. (5) De op FRET gebaseerde kruiscorrelatie CCFFRET van het groene met het rode signaal in het prompttijdvenster is gerelateerd aan fret-geïnduceerde, anticorgerelateerde helderheidsveranderingen in de groene en rodesignalen 31,32,33. Figuur 1: Pulsed-interleaved excitation (PIE) based fluorescence (cross) correlation spectroscopy (F(C)CS). (A) In FCS diffunderen fluorescerend gelabelde moleculen vrij in en uit een (diffractie-beperkt) brandpuntsvolume gevormd door een gefocuste laserstraal die fluorescentie induceert binnen dit kleine volume. De resulterende intensiteitsfluctuaties van moleculen die het volume binnenkomen en verlaten, zijn gecorreleerd en geven informatie over de mobiliteit van de moleculen. (B)In PIE worden twee verschillende laserlijnen (“prompt” en “delay”) gebruikt om het monster te prikkelen dat is gelabeld met twee verschillende fluoroforen (“groen” en “rood”). Het tijdsverschil tussen beide excitatiepulsen is aangepast aan de fluorescentielevensduur van de respectievelijke fluoroforen, zodat de ene is vervallen voordat de andere wordt geëxtteerd. In het getoonde dubbel gelabelde monster zijn beide fluoroforen voldoende dicht bij elkaar om Förster Resonance Energy Transfer (FRET) te ondergaan van de “groene” donorfluoofoor naar de “rode” acceptorfluoofoor. Zo kan rode fluorescentie-emissie worden gedetecteerd in het “prompte” tijdvenster bij excitatie van de groene donor. In de gebruikte opstelling(aanvullende aantekening 2)worden voor elke kleur twee detectoren gebruikt, één georiënteerd evenwijdig aan de excitatiestraaloriëntatie (aangeduid met “p”) en de tweede loodrecht (aangeduid met “s”). (C) Drie verschillende autocorrelatiefuncties kunnen worden bepaald in een OOB-experiment: Correlatie van de i) groene kanaalsignalen in het prompttijdvenster(ACFgp),ii) rode kanaalsignalen in het prompttijdvenster(ACFrp)en iii) rode kanaalsignalen in het vertragingstijdvenster(ACFrd). (D) Er kunnen twee verschillende kruiscorrelatiefuncties worden bepaald: iv) De “OOB”-kruiscorrelatie(CCFOOB)met groene kanaalsignalen in het prompttijdvenster gecorreleerd met de rode kanaalsignalen in het vertragingsvenster, waarbij de amplitude van deze curve gerelateerd is aan de codiffusie van fluoroforen; en v) de “FRET”-kruiscorrelatie(CCFFRET)met de groene kanaalsignalen in het prompttijdvenster gecorreleerd met de rode kanaalsignalen in hetzelfde promptvenster; hier is de vorm van deze curve soms sneller dan diffusie gerelateerd aan de FRET-geïnduceerde intensiteitsveranderingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. CalibratieFiguur 2A-B toont een kalibratiemeting van respectievelijk de afzonderlijk diffurende groene en rode fluoroforen. Op basis van een fit met eq. 1 en de bekende diffusiecoëfficiënt Dgroen26 en Drood27 worden de vorm ( z0 en w 0) en grootte ( Veff) van het detectievolume berekend met behulp van eq. 2a-c. De fitresultaten van de ACFgp van de groene fluorofoor en ACFrd van de rode fluorofoor zijn samengevat in figuur 2C. Beide fluoroforen vertonen een extra relaxatietijdconstante van respectievelijk 8,6 μs (18%) en 36 μs (15%). De moleculaire helderheid (eq. 5a-b) van de groene en rode fluorofoor bedraagt respectievelijk 12,5 kHz per molecuul en 2,7 kHz per molecuul. Voor een betrouwbare schatting van de confocale volumegrootte en -vorm en de moleculaire helderheid, wordt aanbevolen om 3-5 metingen per kalibratie-experimenten uit te voeren en een gezamenlijke (of globale) pasvorm van alle herhalingen. De overspraak α(Figuur 2D, eq. 3) en de directe excitatie van acceptor door de groene laser δ (Figuur 2E, eq. 4) voor dit fluorofoorpaar liggen op respectievelijk ~ 15% en ~ 38%. Figuur 2: Kalibratiemetingen van vrij diffuus groen en rood kalibratiestandaard. (A-B) Representatieve 60 s meting van een 2 nM groene (A) en een 10 nM rode (B) kalibratie standaardmeting gemonteerd op het 3D diffusiemodel inclusief een extra relaxatietijd (eq. 1). De tabel in paneel (C) toont de fitresultaten en de afgeleide parameter op basis van eq. 2a-c en eq. 5a-b. *Diffusiecoëfficiënten zijn ontleend aan literatuur26,27. D) Bepaling van de overspraak α van het groene signaal in de rode kanalen (eq. 3). Het excitatiespectrum van de groene standaard wordt weergegeven in cyaan, het emissiespectrum in groen. De excitatielaserlijnen bij 485 nm (blauw) en 561 nm (oranje) worden weergegeven als stippellijnen. Transparante groene en magenta dozen tonen het verzamelde emissiebereik(aanvullende aantekening 2). (E) Bepaling van de directe excitatie δ van de rode fluorofoor door de 485 nm laser (eq. 4). Kleurcode is identiek aan (D), licht en donkeroranje tonen respectievelijk het excitatie- en emissiespectrum van de rode standaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Om de overlap van het groene en rode excitatievolume te bepalen en te kalibreren, wordt een dubbel gelabelde DNA-dubbelstrengs gebruikt (figuur 3A) zoals hierboven beschreven. Hier zijn de fluoroforen 40 bp uit elkaar geplaatst, zodat er geen FRET kan optreden tussen de groene en rode fluoroforen die aan de uiteinden van de dna-dubbelstrengen zijn bevestigd. Figuur 3B toont de autocorrelaties van zowel fluoroforen in groen (ACFgp) en magenta (ACFrd) en de PIE-kruiscorrelatie, CCFPIE, in cyaan. Houd er rekening mee dat voor CCFPIE het signaal in de groene kanalen in het prompttijdvenster gecorreleerd is met het signaal in de rode kanalen in het vertragingstijdvenster16. Hier wordt een gemiddelde diffusiecoëfficiënt voor de DNA-streng van DDNA = 77 μm²/s verkregen. Meer details over de berekening zijn te vinden in het stap-voor-stap protocol, Aanvullende noot 4. Deze waarde wordt verkregen door de grootte van de gekalibreerde groene en rode detectievolumes (figuur 2) en de respectieve diffusietijden van ACFgp en ACFrd van de DNA-streng (figuur 3C) in vergelijking 2a in te voegen. Vervolgens kan met behulp van de verkregen correctiewaarden rGR en r RG en met behulp van eq. 6 later de hoeveelheid codiffusie, d.w.z. dubbel gelabelde moleculen (of eiwitcomplexen in geval van co-transfectie van twee verschillende eiwitten) worden bepaald uit de celmonsters. Figuur 3: Kalibratie van het groen-rode overlapvolume met behulp van een DNA-monster. (A) De DNA-streng die wordt gebruikt voor kalibratie draagt een groene en een rode kalibratiefluoofoor, met een afstand van 40 bp ertussen. De interdye-afstand moet groot genoeg zijn om FRET tussen de fluoroforen uit te sluiten. (B) Representatieve 60 s meting van een 10 nM DNA-oplossing. Autocorrelaties van zowel fluoroforen in groen(ACFgp,groene standaard) en magenta(ACFrd,rode standaard) en de PIE-crosscorrelatie, CCFPIE,in blauw. De tabel in paneel (C) toont de fitresultaten op basis van het 3D Diffusie model inclusief een extra relaxatie term (eq. 1) en de afgeleide parameter diffusiecoëfficiënt van DNA, DDNA (eq. 2a), de grootte en vorm van het overlapvolume (eq. 2a-c) en de correctieverhoudingen rGR en rRG (eq. 6 ). Houd er rekening mee dat de waarden voor het groene en rode detectievolume (gelabeld met *) zijn ontleend aan de pasvorm van de afzonderlijke fluoroforen in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Experimenten met levende cellenIn de volgende sectie wordt de analyse van live-celexperimenten voor verschillende β2AR-constructies gepresenteerd. Aangezien β2AR een membraaneiwit is, is de diffusie ervan grotendeels beperkt tot een tweedimensionale diffusie (figuur 4A) langs het celmembraan (behalve voor transport- of recyclingprocessen van of naar het membraan) 2. Met de beperking tot de 2D-diffusie raakt de vormfactor s = z0/w0 in eq. 1 overbodig, wat resulteert in een vereenvoudigd diffusiemodel (eq. 9). Enkelvoudig gelabelde constructies: β2AR-IL3-eGFP en NT-SNAP-β2ARFiguur 4 toont voorbeeldige metingen van het single-label construct β2AR-IL3-eGFP (Figuur 4B), waarbij eGFP wordt ingebracht in de intracellulaire lus 3, en de construct NT-SNAP-β2AR (Figuur 4C), waarbij de SNAP-tag wordt geconjugeerd aan de N-terminus van β2AR. De SNAP-tag is gelabeld met een membraandoordringbaar SNAP-oppervlaktesubstraat. De representatieve curven tonen het gemiddelde van 4-6 herhaalde metingen met acquisitietijden van 120 – 200 s elk. De respectievelijke autocorrelaties ACFgp en ACFrd van het eGFP- en SNAP-signaal zijn gemonteerd op een bimodaal, tweedimensionaal diffusiemodel (eq. 9). In termen van snelle dynamiek toont eGFP alleen het verwachte triplet knipperen bij tR1 ~ 9 μs, terwijl het SNAP-signaal twee ontspanningstijden vereist, één bij de typische triplet knippertijd van tR1 ~ 5 μs en een tweede bij tR2 ~ 180 μs. De moleculaire helderheid van de fluoroforen in levende cellen is 0,8 KHz (eGFP) en 1,7 kHz (SNAP) per molecuul onder de gegeven excitatieomstandigheden (eqs. 5a-b). De concentratie van de gelabelde β2AR-constructies die in het celmembraan zijn opgenomen, moet zich in het nanomolaire bereik bevinden en kan worden bepaald door het gemiddelde aantal moleculen (eq. 9, figuur 4C) en de grootte van het respectieve confocale volume voor het groene en rode kanaal (figuur 2) met behulp van eq. 8. Figuur 4: Representatieve meting van single-label constructen. (A) In deze studie werd de membraanreceptor β2AR als voorbeeld gebruikt. In tegenstelling tot de fluoroforen en DNA-streng die worden gebruikt voor kalibratie, die vrij door het detectievolume konden zweven, diffunderen membraaneiwitten voornamelijk zijdelings langs het membraan, beschreven als 2-dimensionale diffusie. (B, D) ACFgp en ACFrd van de single-label constructen β2AR-IL3-eGFP (B) en NT-SNAP-β2AR (D). Getoond is het gemiddelde van 4-6 metingen elk verzameld voor 120 – 200 s. De tabel in paneel (C) toont de fitresultaten van de gegevens naar het bimodale tweedimensionale diffusiemodel inclusief aanvullende relaxatietermen (eq. 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Dubbel gelabelde constructie: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFPIn de dubbel gelabelde constructie NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (kortweg NT-SNAP), wordt eGFP ingevoegd in de intracellulaire lus 3 en wordt de SNAP-tag geconjugeerd naar de N-terminus van β2AR (Figuur 5A). In deze configuratie bevindt de eGFP zich aan de binnenkant van het membraan en de SNAP aan de buitenzijde met te grote afstanden voor FRET. In een ideaal geval zou deze constructie 100% co-diffusie van de groene en rode fluorofoor vertonen en geen FRET-signaal. Figuur 5B-D toont twee metingen van de NT-SNAP in twee cellen op twee verschillende meetdagen. Het aanpassen van de ACFgp en ACFrd van de “betere” meting getoond in figuur 5B met eq. 7 en de CCFPIE met eq. 9, onthult 50- 60 moleculen in focus voor de ACFgp en ACFrd, terwijl Napp, dus 1/G0(tc) ~ 114 voor de CCFPIE (Figuur 5C ). De concentratie van gelabelde receptoren ligt in het ~100 nM bereik zoals bepaald met eq. 8. Om de gemiddelde concentratie van dubbel gelabeldemoleculente bepalen, wordt eerst de verhouding van G 0 (tc) (weergegeven door 1 /N(app)) van de CCFPIE tot respectievelijk ACFgp en ACFrdberekend (eq. 6). Vervolgens worden deze waarden, rGRcell= 0,43 en rRGcell = 0,53, vergeleken met de waarden verkregen uit de DNA-meting (rGR,DNA= 0,51 en rRG,DNA = 0,79 op deze meetdag). Met behulp van de regel van verhoudingen reflecteert een rGRcell= 0,43 van de ACF-gp van het eGFP-signaal op een fractie van codiffusie (rGRcell/rGR, DNA) van 0,84, waar voor het andere geval van ACFrd van het SNAP-substraatsignaal deze waarde 0,67 bedraagt. De gemiddelde concentratie van de dubbel gelabelde NT-SNAP-constructie kan uiteindelijk worden berekend op basis van eq. 10. In de meting in figuur 5D van een andere dag daarentegen is de concentratie van receptoren vrij laag en de gegevens zeer luidruchtig, zodat het pasvormbereik beperkt is tot ~ 10 μs. Bovendien wordt slechts een lage hoeveelheid codiffusie waargenomen (15 – 26%). Figuur 5: Dubbel gelabelde NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP construct. (A) In de dubbel gelabelde constructie wordt de eGFP in de intracellulaire lus 3 geplaatst en de SNAP-tag bevestigd aan de N-terminus van β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd en CCFPIE van twee metingen van de dubbel gelabelde constructie. De gegevens zijn geschikt voor een bimodaal tweedimensionaal diffusiemodel (eq. 9, CCFPIE) en bevatten aanvullende relaxatietermen (eq. 7, ACFgp en ACFrd). De tabel in paneel (C) toont de fitresultaten en de afgeleide parameterconcentratie (eq. 8), de verhouding van de correlatieamplitude bij nul correlatietijd (G0(tc)) en de fractie van codiffuserende moleculen (eq. 10). Merk op dat de metingen op verschillende dagen werden verkregen, dus iets andere factor voor de amplitudecorrectie werd gebruikt (B: rGR, DNA = 0,51 en r RG, DNA = 0,79; D: rGR,DNA = 0,51 en rRG,DNA = 0,56). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Dubbel gelabelde constructie die FRET ondergaat: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAPIn de dubbel gelabelde constructie β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Figuur 6A), wordt de eGFP ingebracht in de intracellulaire lus 3 identiek aan de NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-constructie met de SNAP-tag bevestigd aan de C-terminus. Hier bevinden beide etiketten zich aan dezelfde kant van het plasmamembraan van de cellen, zodat de fluoroforen zich in de onmiddellijke nabijheid bevinden, zodat FRET optreedt zoals aangegeven door de gebluste eGFP-levensduur (aanvullende aantekening 5). Gezien de flexibiliteit van relatief ongestructureerde eiwitgebieden zoals de C-terminus34 en ten minste twee verschillende eiwitconformaties van GPCRs35, “high FRET” (HF) of “low FRET” (LF), kunnen dynamische veranderingen in de FRET-efficiëntie als gevolg van eGFP-SNAP-afstandsveranderingen worden waargenomen en geïdentificeerd door een anticorrelatieterm in de CCFFRET (oranje curve in figuur 6B ). Van FRET-fluctuaties is aangetoond dat ze anticorrelerend zijn, omdat de receptor zich slechts in één toestand tegelijk kan bevinden, HF of LF. Gezamenlijke (of globale) fit van alle vijf correlatiecurven(Figuur 6B)onthult ~ 70% van de langzaam diffunderende moleculen bij ~ 100 ms, terwijl de rest diffundeert met ~ 1 ms. Alle autocorrelaties en CCFFRET vertonen ontspanningsvoorwaarden bij 37 μs en 3 μs; die correlaties gedomineerd door rood signaal (ACFrp, ACFrd en CCFFRET) vertonen een extra langzame component ~ 50 ms (Figuur 6C). FRET-geïnduceerde veranderingen op de CCFFRET onder verschillende omstandigheden (Figuur 6D) worden aangetoond door een reeks simulaties van een tweestatensysteem met een fluctuatietijd van 70 μs tussen LF- en HF-toestanden. Bij het overschakelen van de LF naar de HF-toestand worden veranderingen in het anticorrele signaal waargenomen in het prompttijdvenster: het groene signaal neemt af en het rode signaal neemt toe (vice versa voor de HF -> LF-schakeling). Als HF-LF-schakeling op tijdschalen sneller optreedt dan de diffusietijd, met andere woorden tijdens de verblijftijd van het molecuul in de focus, kan de snelheid worden afgeleid van de anticorrelatie in de CCFFRET6,31,36. Houd er rekening mee dat dynamische processen die langzamer zijn dan de diffusietijd niet kunnen worden waargenomen in FCS. In deze demonstratie werden twee verschillende FRET-scenario’s verondersteld, die een gematigde of maximale verandering in FRET-efficiëntie tussen de twee staten laten zien. De simulaties werden uitgevoerd met Burbulator37 en houden rekening met afwezigheid of aanwezigheid van triplet knipperen en toenemende hoeveelheid donoroverspraak in de rode kanalen. De diffusieterm werd gemodelleerd als een bimodale verdeling met 30% van de snel diffunderende moleculen bij tD1 = 1 ms en de rest van de moleculen die langzaam diffunderen met tD2 = 100 ms. In totaal werden 107 fotonen gesimuleerd in een 3D Gaussvormig volume met w0 = 0,5 μm en z0 = 1,5 μm, een doosgrootte van 20 en NFCS = 0,01. Figuur 6E-F toont de simulatieresultaten voor de FRET-geïnduceerde kruiscorrelatie CCFFRET voor matig (Figuur 6E) en maximaal FRET-contrast ( Figuur6F) in afwezigheid (ononderbroken lijnen) en aanwezigheid van triplet knipperen (stippellijnen). De FRET-geïnduceerde anticorrelatie is gemakkelijk te zien in figuur 6F. Het “dempende” effect bij het toevoegen van een extra triplettoestand vermindert de correlatieamplitude (Figuur 6E-F)38,39. Figuur 6: Simulatie van dubbel gelabeld monster met dynamische FRET. (A) Dubbel gelabelde β2AR met een eGFP ingebracht in de intracellulaire lus 3 en een C-terminal SNAP-tag. Beide fluoroforen zijn dichtbij genoeg om FRET te ondergaan en vertonen veranderingen in de FRET-efficiëntie als de receptor eiwitdynamiek ondergaat. (B) Autocorrelatie (ACFgp, ACFrp en ACFrd, fit met eq. 7) en kruiscorrelatiecurven (CCFFRET (eq. 7) en CCFPIE (eq. 9)) van een voorbeeldmeting. Tabel in paneel (C) toont de fit resultaten. (D-F) Om de invloed van experimentele parameter op de verwachte, FRET-geïnduceerde anticorrelatieterm aan te tonen, werden 12 simulaties uitgevoerd, waarin de verandering in de FRET-efficiëntie (klein of groot), verschillende hoeveelheid donoroverspraak in de acceptorkanalen (0%, 1% of 10%) en de afwezigheid en aanwezigheid van triplet knipperen werden gemodelleerd. De evenwichtsfractie van beide FRET-toestanden werd verondersteld op 50:50 en hun wisselkoersen werden zodanig aangepast dat de verkregen relaxatietijd tR = 70 μs. Meer details over de simulaties zie je in de tekst. (E) CCFFRET van de simulatieresultaten met een matig FRET-contrast en bij afwezigheid van overspraak (donkeroranje), 1% overspraak (oranje) en 10% overspraak (lichtoranje). Ononderbroken lijnen tonen resultaten in afwezigheid van triplet, stippellijnen in de aanwezigheid van triplet. (F) CCFFRET van de simulatieresultaten met maximaal FRET-contrast. De kleurcode is identiek aan (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. In de simulatie die het meest lijkt op de experimentele omstandigheden (α = 10%, 15% triplet knipperend en matig FRET-contrast, onderbroken gele lijn in figuur 6E), is de anticorrelatieterm echter bijna verminderd. Figuur 7 toont het resultaat van het analyseren van deze gesimuleerde gegevens met behulp van de informatie gecodeerd in de histogrammen van de aankomsttijd van het foton (d.w.z. de fluorescentielevensduur) door middel van FluorescentieLevenscorrelatiespectroscopie (FLCS)17,19 of soortgefilterde FCS (fFCS)18. Hier worden de fluorescentielevensduur van de bekende HF- en LF-soorten (figuur 7A) gebruikt om gewichten of “filters” (figuur 7B) te genereren die tijdens de correlatieprocedure worden toegepast. In de verkregen soort-auto- en kruiscorrelatiecurven (figuur 7C-D) is de anticorrelatie duidelijk waarneembaar. Figuur 7: Levenslang gefilterd FCS kan helpen om de op eiwitdynamiek gebaseerde fluctuaties in FRET-efficiëntie bloot te leggen in monsters met een hoge overspraak, significant triplet knipperen of andere fotofysische of experimentele eigenschappen die de FRET-geïnduceerde anticorrelatie in de CCFFRETmaskeren. Hier wordt de benadering voorbeeldig weergegeven voor de gegevens in figuur 6E voor de simulatie met 10% overspraak en 5% triplet knipperen. (A) Genormaliseerde fluorescentie intensiteit vervalpatronen voor de twee FRET-soorten (licht en donkergroen voor respectievelijk hoge en lage FRET) en de IRF (grijs). Het patroon voor het parallelle detectiekanaal wordt weergegeven in ononderbroken lijnen, stippellijnen voor het loodrechte detectiekanaal. (B) De wegingsfunctie of “filter” is gegenereerd op basis van de patronen die worden weergegeven in (A), kleurcode is identiek aan (A). Houd er rekening mee dat alleen het signaal in de groene detectiekanalen, en dus de FRET-geïnduceerde donorblussing, hier in aanmerking wordt genomen. (C) Vier verschillende soortselectieve correlaties worden verkregen: soort-autocorrelaties van de lage FRET-toestand(sACFLF-LF,donkergroen) en de hoge FRET-toestand(sACFHF-HF,lichtgroen), en de twee soorten-kruisverwijzingen tussen de lage FRET-toestand naar de hoge FRET-toestand(sCCFLF-HF,donkeroranje) en vice versa (sCCFHF-LF , oranje). De sCCF toont duidelijk de anticorrelatie in het μs-bereik. Onderbroken zwarte lijnen geven de pasvormen aan. sACF waren geschikt voor eq. 9 en sCCF met eq. 11. Tabel in paneel (D) toont de fit resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. CCFPIE amplitude om eiwit-eiwitinteractie (PPI) te bestuderenTen slotte is een veel voorkomende use case voor PIE-gebaseerde FCS in levende cellen het bestuderen van de interactie tussen twee verschillende eiwitten. Hier is de uitleesparameter de amplitude van de CCFPIE, of beter gezegd de verhouding van de autocorrelatieamplitudes ACFgp en ACFrd tot de amplitude van CCFPIE. Om het effect van toenemende co-diffusie op CCFPIEaan te tonen, zijn simulaties uitgevoerd op basis van de twee single-labeled constructen, β2AR-IL3-eGFP en NT-SNAP-β2AR(Figuur 8A). Figuur 8B laat zien hoe de amplitude van CCFPIE toeneemt wanneer de fractie van co-diffuserende moleculen verandert van 0% naar 100%. Houd er rekening mee dat een 1% overspraak van groen signaal in de rode kanalen in het vertragingstijdvenster is toegevoegd met de diffusiecomponenten die anders zijn gemodelleerd zoals hierboven weergegeven. Figuur 8: De CCFPIE kan worden gebruikt om de interactie van twee eiwitten te bestuderen. (A) Hier werd een co-transfectiestudie van β2AR-IL3-eGFP met NT-SNAP-β2AR (met een “rood” SNAP-label) gesimuleerd. (B) Voor een toenemend aantal co-diffuserende moleculen (0% (donkerblauw) -> 100% (lichtblauw)) neemt de amplitude G(tc) toe. De diffusieterm werd opnieuw gemodelleerd als een bimodale verdeling met 30% van de snel diffunderende moleculen bij tD1 = 1 ms en de rest van de moleculen die langzaam diffunderen met tD2 = 100 ms. Daarnaast werd 1% overspraak van groen signaal in het rode vertragingstijdvenster toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Symbool Betekenis (gemeenschappelijke eenheid) α overspraak van de groene fluorofoor na groene excitatie in de rode detectiekanalen (%) een1 fractie van de eerste diffusiecomponent in bimodale diffusiemodel van membraanreceptoren eenf totale amplitude van de anticorrelatieterm eenR amplitude van fotofysica /triplet knipperen b baseline / offset van een correlatiecurve B moleculaire helderheid van een fluorofoor ((kilo-)tellingen per molecuul en seconde) BG achtergrond (bv. uit een geschikt referentiemonster: ddH2O, buffer, niet-getransfecteerde cel enz.) c concentratie CR telsnelheid (KHz of (kilo-) tellingen per seconde) δ directe excitatie van de rode fluorofoor na groene excitatie (%) D diffusiecoëfficiënt (μm²/s) G(tc) correlatie functie N aantal moleculen in focus NA Avogadro’s nummer (6.022*1023 Mol-1) rGR,rRG amplitudeverhouding van groene of rode autocorrelatiefunctie tot de op PIE gebaseerde kruiscorrelatiefunctie s vormfactor van confocaal volume-element tc correlatietijd (meestal in milliseconden) tD diffusietijd (meestal in milliseconde of microseconde) tR ontspanningstijd van fotofysica (meestal in microseconde) tT ontspanningstijd van triplet knipperen (meestal in microseconde) w0 halve breedte van confocaal volume-element (μm) Z0 halve hoogte van confocale volume-element (μm) Tabel 1: Lijst van variabelen en afkortingen. Voor het gebruik van symbolen en definities in fluorescentie- en FRET-experimenten worden de richtlijnen van de FRET-gemeenschap40 aanbevolen. AANVULLENDE BESTANDEN: SuppNote1_Coverslip schoonmaken.docx Klik hier om dit bestand te downloaden. SuppNote2_Confocal Setup.docx Klik hier om dit bestand te downloaden. SuppNote3_Data exporteren.docx Klik hier om dit bestand te downloaden. SuppNote4_FCCS kalibratieanalyse met ChiSurf.docx Klik hier om dit bestand te downloaden. SuppNote5_Fluorescence levenslange histogrammen.docx Klik hier om dit bestand te downloaden. S6_Scripts.zip Klik hier om dit bestand te downloaden. S7_Excel_templates.zip Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

FCS-technieken in GPCRs maken het mogelijk de mobiliteit en interacties van receptoren in levende cellen te beoordelen⁴¹. Het voordeel van de FRET-FCS techniek is dat, naast mobiliteit, de conformatiedynamiek van GPCRs kan worden onderzocht. Het uitvoeren van FRET-FCS in levende cellen is echter een uitdaging en vereist cellen die een lage (of maximaal matige) expressie van het fluorescerend gelabelde eiwit van belang vertonen, een goed gekalibreerde opstelling en een goede pijplijn om gegevens te analyseren. Hier worden eerst de kritische punten in de monstervoorbereiding en experimentele procedure besproken met betrekking tot de biologische, spectroscopische en technische gezichtspunten.

Kritische experimentele stappen omvatten het minimaliseren van de achtergrond en autofluorescentie (door het gebruik van uitgebreid gereinigde coverslips en fenolrode vrije media), de optimalisatie van transfectieomstandigheden (bijv. Hoeveelheid plasmide-DNA en tijd na transfectie) om lage expressieniveaus en efficiënte etikettering te bereiken. Natuurlijk is het ook van vitaal belang om ervoor te zorgen dat de functie van het gelabelde eiwit niet wordt belemmerd. In live-celexperimenten wordt de beslissing voor de etiketteringsstrategie en labelpositie dus vaak genomen ten gunste van fluorescerende eiwitten of SNAP / CLIP-tag bevestigd aan de flexibele N- of C-terminus⁴²^,⁴³. Alternatieve etiketteringsstrategieën zoals het invoegen van een onnatuurlijk aminozuur met een reactieve zijketen voor etikettering met een organische fluorofoor zijn de afgelopen jaren in opkomst⁴⁴.

Voor dual-color PIE-FCS, waarbij alleen de interactie van twee interessante moleculen moet worden onderzocht, kunnen de fluoroforen worden geselecteerd uit een grote verscheidenheid aan gevestigde fluorescerende eiwitten of SNAP / CLIP-substraten. Hier zou het doel van spectroscopie moeten zijn om een paar zodanig te selecteren dat er weinig overspraak of directe acceptor-excitatie optreedt. Bovendien moeten de geselecteerde fluoroforen fotostabiel zijn en weinig of geen bleken vertonen onder de gekozen experimentele omstandigheden. Het wordt aanbevolen om fluoroforen in het rode spectrale bereik te selecteren, omdat (1) de autofluorescentieachtergrond van de cel wordt verminderd en (2) het excitatielicht een langere golflengte heeft, dus minder fototoxisch¹⁴. Fotobleaching kan worden geminimaliseerd door eerst een zogenaamde “power series” uit te voeren, waarbij het laservermogen stapsgewijs wordt verhoogd en de moleculaire helderheid wordt waargenomen. Het optimale excitatie-intensiteitsbereik ligt in het lineaire bereik van de resultaten⁴⁵.

Als de twee labels ook moeten rapporteren over eiwitconformatiedynamiek via FRET, is de keuze van beschikbare fluoroforen beperkter. Hier moet de mogelijke minimale /maximale afstand tussen de twee fluoroforen vooraf worden geschat, bijvoorbeeld op basis van beschikbare structuren of moleculaire grootte, en een fluorofoorpaar geselecteerd met een redelijke Förster-straal R_0, zodat FRET daadwerkelijk²⁰kan voorkomen .

Hier werden eGFP en een SNAP-tag gekozen voor etikettering en de SNAP-tag werd gelabeld met een intracellulair of een membraan-ondoordringbaar oppervlaktesubstraat. De spectra zijn vergelijkbaar met die in figuur 2C-D. Deze combinatie van fluoroforen vertoont een hoge overspraak van de eGFP in de rode detectiekanalen en directe acceptor excitatie van het SNAP-substraat door de groene excitatie in het prompttijdvenster en resulteert in een significant “vals” signaal in de rode kanalen in het prompttijdvenster. Idealiter mogen beide waarden, cross talk en directe acceptor excitatie, niet hoger zijn dan 5%^5,^6,³⁸. Met een Förster-straal van 57 Å is het echter bij uitstek geschikt om de afstand tussen de etiketten in de β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-constructie te onderzoeken, zoals kan worden geëvalueerd op basis van de gebluste eGFP-levensduur (aanvullende aantekening 5).

Technisch gezien, zoals voor elk fluorescentiespectroscopie-experiment, moet het apparaat goed zijn uitgelijnd en geschikte excitatiebronnen, emissiefilter en gevoelige detectoren bezitten. Om te voorkomen dat artefacten van detector napulsing op de μs-tijdschaal, moeten ten minste twee detectoren van elke kleur aanwezig zijn, die kruisgecorreleerd kunnen zijn. In moderne tijdgecorreleerde elektronica voor het tellen van enkele fotonen speelt de dode tijd van de detectiekaart in het ns-tijdbereik nauwelijks een rol vanwege de onafhankelijke routeringskanalen, maar deze kan worden gecontroleerd zoals voorgesteld door Müller et al ^16, op voorwaarde dat het tijdsbereik van belang ligt in het sub-μs / ns-tijdbereik. Bovendien moet voor nog hogere tijdresoluties in het ps-bereik elk detectiekanaal worden verdubbeld, d.w.z. dat er vier detectoren per kleur moeten worden gebruikt, om ook de dode tijden van de detector^2,^15,^29,⁴⁶te omzeilen. Hoewel de gemiddelde fluorescentielevensduur kan worden geschat met behulp van niet-gepolariseerde fluorescentiedetectie, moet voor analyse van de afstand (~ verdeling) tussen de fluoroforen de emissie polarisatieafhankelijk worden verzameld. Dit komt door het feit dat de efficiëntie van de energieoverdracht in FRET afhankelijk is van de oriëntatie van de twee fluoroforen. Meer gedetailleerde informatie vindt u hier^20,^28,⁴⁷. Ten slotte is in OOB-experimenten de afstand tussen de prompt- en vertragingspuls van cruciaal belang en moet deze zodanig worden gekozen dat de fluorescentie-intensiteit van de fluoroforen grotendeels is vervallen (figuur 1B). Een gangbare regel is om de twee pulsen 5x de fluorescentielevensduur uit elkaar te plaatsen, d.w.z. voor eGFP met een fluorescentielevensduur van 2,5 ns moet de afstand 12,5 ns zijn bij minimaal²².

Na alle overwegingen voor de experimentele procedure te hebben uitgewerkt, worden de gegevens en de analyse ervan in meer detail besproken. Zoals vermeld in het protocolgedeelte, moet de uitlijning van de opstelling dagelijks worden gecontroleerd, inclusief de analyse van de kalibratiemetingen. De gegevens in figuur 2A-C tonen bijvoorbeeld een extra ontspanningscomponent in het bereik van 8-40 μs. Het is bekend dat het typische triplet knipperen van de groene kalibratiefluoofoor voorkomt in het bereik van 2-10^{μs 13,}^15,^48. De langzame relaxatiecomponent die nodig is in alle curven van het DNA-monster(figuur 3C),te langzaam voor daadwerkelijk triplet knipperen, kan voortkomen uit interacties van het DNA met de fluoroforen³⁹. Deze component zou echter niet worden verwacht in CCF_PIEen komt hoogstwaarschijnlijk voort uit resterende overspraak. Het is daarom zeer raadzaam om de analyse van de kalibratiemonsters direct voorafgaand aan de celexperimenten uit te voeren om de kwaliteit van de uitlijning van de dag te beoordelen.

De juiste kalibratie van het confocale overlapvolume vereist een monster met 100% co-diffusie van het groene en rode label. Hier wordt fluorescerend gelabeld dubbelstrengs DNA gebruikt. Beide DNA-strengen kunnen worden aangepast om de gewenste fluoroforen op de vereiste afstand van elkaar te hebben. De ontworpen strengen kunnen met een hoog rendement worden gegloeid. Good Laboratory Practice adviseert echter om de integriteit en etiketteringsgraad van de DNA-strengen te controleren door middel van agarosegel-elektroforese en het meten van het absorptiespectrum. Ook moet de opbrengst van de dubbelstrengs assemblage worden gecontroleerd, omdat deze kalibratiemeting kritisch afhankelijk is van de veronderstelling dat er een 100% co-diffusie van het groen is met het rode label. In het geval dat de veronderstelling niet geldig is, moeten mogelijk correctiefactoren worden toegepast^16,²². Bij de kalibratiemetingen in figuur 2 en figuur 3werd een detectievolume van respectievelijk 1,4 fL en 1,9 fL in het groene en rode kanaal verkregen. Dit verschil in grootte wordt verwacht voor een opstelling met bijna diffractie-beperkte excitatievolumes (aanvullende aantekening 2). Onder deze voorwaarde schaalt de grootte van het excitatievolume met de excitatiegolflengte. Dit verklaart op zijn beurt de verschillende correlatieamplitudes waargenomen in figuur 3B. De afgeleide correctiefactoren r_GR = 0,56 en r_RG = 0,72 corrigeren voor dit grootteverschil en potentiële niet-perfecte overlap van de twee excitatievolumes³^,⁴.

Figuur 4, figuur 5, figuur 6en figuur 7 tonen de workflow van een op PIE-F(C)CS gebaseerde studie gericht op het begrijpen van conformatie-eiwitdynamica. Ten eerste dienen de twee enkelvoudig gelabelde constructies β₂AR-IL3-eGFP en NT-SNAP-β₂AR als controles om de fluorofooreigenschappen in cellen te karakteriseren in afwezigheid van de respectieve andere fluorofoor (Figuur 4). Vervolgens dient de dubbel gelabelde constructie NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP met een SNAP-tag naar de buitenkant van de cel en een eGFP aan de cytoplasmatische kant als een “100% co-diffusie” -controle(figuur 5). De laatste constructie, β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, draagt beide fluoroforen aan de cytoplasmatische kant en dicht genoeg bij elkaar om FRET te ondergaan. Ook hier zou een 100% co-diffusie worden verwacht in combinatie met anti-gecorreleerde intensiteitsfluctuaties in het groene en rode kanaalsignaal in het prompte tijdvenster, d.w.z. na donorexcitatie, als gevolg van eiwitdynamiek die de FRET-efficiëntie beïnvloedt^31,^32,³³. Deze dynamiek kan zich uiten als anticorrelatie in de CCF_FRET (figuur 6-7).

Alle GPCR β₂AR-constructies vertonen bimodale diffusie op het celmembraan(figuur 4A). Terwijl de β₂AR-IL3-eGFP alleen het verwachte triplet knipperen laat zien (Figuur 5B)¹³^,¹⁵, NT-SNAP-β₂AR een extra langzame relaxatietijd ( Figuur5C-D). Het is waarschijnlijk dat t_R2 afkomstig is van ongebonden SNAP-substraat. Dit kan worden opgehelderd door verdere experimenten, bijvoorbeeld door ook de diffusie en fotofysische eigenschappen van het gebruikte SNAP-substraat in een waterige oplossing te meten. Van belang is dat een eenvoudig experiment om onderscheid te maken tussen diffusie- en ontspanningstijden is om het gaatje van de confocale opstelling te veranderen, d.w.z. het effectieve volume te vergroten: terwijl de diffusietijden toenemen met toenemende effectieve volumes, zijn ontspanningsvoorwaarden ongewijzigd¹³. Houd er bij het bepalen van de concentratie fluorescerend eiwit (FP) op basis van de fit-resultaten rekening mee dat FP’s in het algemeen een rijpingsproces ondergaan, waarbij uiteindelijk de chromofoor wordt gevormd¹². Deze rijpingstijd kan verschillen van FP tot FP naast fotofysica die afhankelijk is van de lokale chemische omgeving¹³^,¹⁵. De werkelijke eiwitconcentratie in het door FCS gerapporteerde monster wordt dus meestal onderschat, wat kan worden gecorrigeerd als de fractie van niet-fluorescerende FP’s in het experiment kan worden bepaald. Ten slotte is het raadzaam om de fluorofoorspectra in levende cellen te controleren om de waarden voor α en δ te corrigeren, indien nodig, omdat de meeste fluoroforen gevoelig reageren op hun omgeving^13,^15,⁴⁸. De achtergrond om af te trekken wordt bepaald door het signaal dat wordt verzameld in niet-getransfecteerde cellen. Bovendien moet de autocorrelatie van het respectieve andere kleurkanaal en de CCF_PIE worden gecontroleerd om valse signalen te kunnen identificeren (aanvullende aantekening 4 – figuur 30).

De twee metingen van de NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (Figuur 5D), waarbij de fluoroforen zich aan verschillende zijden van het membraan bevinden, werden op verschillende dagen verkregen en tonen het belang van statistieken in tijd-opgeloste single molecule fluorescentie. Hier kunnen de verschillende resultaten te wijten zijn aan de verschillende mate van etikettering: in de ene cel resulteerde de hogere mate van labeling en middeling van metingen in relatief weinig ruis (figuur 5B), terwijl van de andere cel slechts twee metingen konden worden verzameld (figuur 5A). Naast het verzamelen van voldoende gegevens, is het van cruciaal belang om de resultaten tijdig te evalueren en misschien de etiketteringsstrategie te optimaliseren. Bij het ontwerpen van de experimenten is het belangrijk om te onthouden dat FRET gevoelig is, maar beperkt tot afstanden tot 10 nm en anders “blind”. In ons geval wordt deze “blindheid” aangegeven door de ongewijzigde eGFP-fluorescentielevensduur (aanvullende aantekening 5). In de β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-constructie(figuur 6A)kan FRET worden vastgesteld vanaf de uitgebluste eGFP-levensduur (aanvullende aantekening 5). Er wordt echter geen anticorrelatieterm waargenomen (figuur 6B), wat betekent dat FRET niet fluctueert of op een tijdschaal langzamer is dan de diffusietijd. Er zijn maximaal drie aanvullende versoepelingsvoorwaarden vereist in ACF_gp, ACF_rp, ACF_rd en CCF_FRET (Figuur 6C). De langzame component in ACF_rp, ACF_rd en CCF_FRET kan te wijten zijn aan acceptorbleking en beïnvloedt natuurlijk de verkregen waarde van de langzame diffusie in deze curven (~ 350 ms vergeleken met 117 ms in ACF_gp). t_D in het rode kanaal wordt verondersteld iets groter te zijn dan in het groene kanaal vanwege de confocale volumes van verschillende grootte (figuur 2) – maar alleen met een factor die vergelijkbaar is met het grootteverschil. De zeer snelle relaxatietijd van 3 μs weerspiegelt het triplet knipperen van de fluoroforen^13,^15,^48,terwijl de langzamere relaxatietijd van 37 μs te wijten kan zijn aan FRET: Evenzo, als FRET een anticorrelatie induceert in de CCF_FRET,worden positieve correlaties verwacht in de autocorrelaties^31,^32,³³. De aanwezigheid van deze term als “positief” in CCF_FRET en de aanwezigheid ervan in de ACF_rd kan worden verklaard met de hoge overspraak en moet verder worden opgehelderd. Merk op dat de CCF_PIE vlak is op korte correlatietijden zoals verwacht.

Aan de andere kant moet worden opgemerkt dat het optreden van FRET in een interessant systeem leidt tot niet-lineaire effecten op de correlatiecurven⁶. De moleculaire helderheid van bijvoorbeeld een molecuul schaalt in de correlatie amplitude in het kwadraat en elke FRET-toestand (en de altijd aanwezige moleculen zonder actieve receptor) vertoont een andere moleculaire helderheid. INDERDAAD, FRET verlaagt de schijnbare concentratie van gedetecteerde groene moleculen (d.w.z. verhoogt de amplitude van ACF_gp) en het aantal rode moleculen (bepaald aan de hand van rode prompt) wordt overschat⁵. Beide effecten beïnvloeden de hoeveelheid interactie afgeleid van zowel CCF_FRET als CCF_PIE. Globale analyse zoals bijvoorbeeld voor de intramoleculaire dynamica van Calmodulin ^{31 , 32}of Syntaxin³³ kan echter de eiwitdynamiek onthullen. Wanneer zorgvuldig gekalibreerd, kan de gemiddelde FRET-efficiëntie worden geëxtraheerd uit de relatieve CCF_PIE en ACF-amplitudes²², terwijl de beperkende toestanden kunnen worden bepaald uit de analyse van de levensduurverdeling van donorfluorescentie³³.

Gezien het feit dat in levende celexperimenten met grote fluoroforen zoals eGFP het FRET-contrast waarschijnlijk nog lager is dan wordt aangenomen voor de simulaties in figuur 6 en dat de directe excitatie van de acceptor niet in de simulatie is toegevoegd, zou dit kunnen verklaren waarom de identificatie van de anticorrelatie in levende celexperimenten zeer uitdagend is. Een veelbelovend analysealternatief is gebaseerd op het oogsten van de informatie die is gecodeerd in de histogrammen met de aankomsttijd van fotonen(figuur 1B)die toegankelijk zijn vanwege de tijdgecorreleerde gegevensverzameling van één foton^29,³⁰. Als de fluorescentielevensduur (~patronen) van de twee (of meer) (FRET) soorten in het monster bekend zijn(figuur 7A),kunnen “filter” of gewichten worden gekozen die tijdens het correlatieproces worden toegepast(figuur 7B)^17,^18,¹⁹. De aldus verkregen correlatiecurven vertegenwoordigen niet langer de correlatie van detectiekanalen, maar eerder de auto- of kruiscorrelaties tussen twee verschillende (FRET) soorten, dus omgedoopt tot species-ACF (sACF) of species-CCF (sCCF). Door deze benadering toe te passen op de gesimuleerde gegevens met matig FRET-contrast, hoge overspraak en triplet knipperen, wordt de anticorrelatieterm hersteld(figuur 7C-D). Er moet echter worden opgemerkt dat ontspanningstijden kunnen worden verkregen, maar de relatie met amplitude gaat verloren¹⁸. Deze benadering is eerder toegepast in experimenten met levende cellen, bijvoorbeeld om de interactie van EGFR met zijn antagonist⁴⁹ te bestuderen of om de fluorescentie te scheiden van eiwitten die zijn gehecht aan eGFP-varianten met uitzonderlijk korte en lange fluorescentielevensduur⁵⁰.

Terwijl PIE-gebaseerde FRET-metingen in gezuiverde eiwitten grotendeels worden gebruikt om eiwitdynamica³⁶²²te bestuderen, richt het zich in levende cellen op het begrijpen van eiwit-eiwitinteracties. Deze benadering is toegepast om de regulatie van MAP-kinaseactiviteit in gist⁵¹ te bestuderen of om de interactie van membraaneiwitten met hun cytosolische bindingspartner op te lossen zoals samengevat in dit recente artikel⁵². Hier kunnen complicaties optreden wanneer significante overspraak van groene fluoroforen nog steeds aanwezig is in het vertragingstijdvenster van de rode kanalen of rood signaal in de groene kanalen in het prompttijdvenster. De eerste kan worden veroorzaakt door een onvoldoende vertraging van de rode puls ten opzichte van de groene puls, terwijl beide effecten voortkomen uit te sterk overlappende excitatie- en emissiespectra van de gekozen fluoroforen. Het wordt aanbevolen om de respectieve enkel gelabelde constructies zorgvuldig te controleren en te corrigeren voor vals-positieve CCF PIE-amplitudes, vooral in cellen waar autofluorescentie met een zeer korte fluorescentielevensduur een andere complicerende factor²²kan zijn .

Kortom, de HIER beschreven FRET-FCS-benadering heeft een groot potentieel om eiwit-eiwitinteracties en eiwitdynamiek in levende cellen bij bijna fysiologische concentraties te begrijpen. In dit protocol werd de nadruk gelegd op de benodigde kalibratiemetingen en de noodzakelijke kwantitatieve analyse die tijdens live cell metingen moest worden uitgevoerd. Hiertoe werden verschillende live celmetingen getoond, aangevuld met simulaties. De simulaties bieden hier het algemene inzicht, omdat de parameter systematisch kan worden gevarieerd met op maat gemaakte pasvormmodellen die de specifieke mobiliteit en fotofysische eigenschappen van de respectieve gegevens beschrijven. De analyse werd uitgevoerd met open-source softwaretools met een uitgebreid stap-voor-stap protocol en eenvoudig aan te passen sjablonen. Ten slotte zullen de technische vooruitgang, en dus de beschikbaarheid van kant-en-klare stabiele PIE-FCS-systemen samen met de verspreiding van open-source software voor data-analyse, deze techniek steeds toegankelijker maken voor een grotere onderzoeksgemeenschap om uiteindelijk eiwitinteractie en -dynamiek in levende cellen met de hoogste gevoeligheid te ontrafelen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projectnummer 374031971, Project INF) aan J.B. en K.G.H.

We danken het Rudolf Virchow Center voor financiële steun en Core Unit Fluorescence Imaging voor technische ondersteuning. Daarnaast bedanken we Ashwin Balakrishnan voor het grondig proeflezen.

Materials

1x Telescope in 4f configuration with five lenses	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Band pass filters Brightline	AHF, Tübingen, Germany	HC 525/50 and HC 600/52	Filter
2x Dichroic beam splitter	AHF, Tübingen, Germany	HC BS F38-573	Filter
6-well culture plate Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20000	Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20003	Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany	WK-XYB-PZ-IX71	Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Germany	SPCM-AQR-14	Single photon counting detector
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Germany	10FC16PB.3	Filter
Biorender (Software)	Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada)	—	Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line	ATCC	CCL-61	Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software)	Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA	—	tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Reagent
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)	A3672,0250	Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance)	IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany)	—	Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Reagent
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M	Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S 0615	Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Canada	XI120-Q-5060	Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9105S	Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9112S	Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	111640	Reagent
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Germany	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm)	Picoquant, Berlin, Germany	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	11668-019	Reagent
MFD suite (Software)	AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany	—	Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	AC254-150-A-ML	Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	640110	Reagent
Olympus IX 71 stand	Olympus, Hamburg, Germany	IX2-ILL100	Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Reagent
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	14190144	Reagent
Pinhole (50 µM)	Newport, Darmstadt, Germany	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Germany	932200 (PMA Hybrid 40)	Single photon counting detector
Python scripts (Software)	Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany	—	Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tübingen, Germany	F73-421PH	Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator	Picoquant, Berlin, Germany	02126	Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	6771.1	Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)	Picoquant, Berlin, Germany	931073 (SPT64-1+2 single user )	Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Germany	930010 (Hydraharp 400)	Optics
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	ACN127-020-A	First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Germany	UPLSAPO60XW	Objective

References

Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS–friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
Thompson, N. L., Lakowicz, J. R. . Topics in Fluorescence Spectroscopy. , 337-378 (1991).
Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Automatically Generated

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

Automatically Generated

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below