التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية
Summary
نقدم بروتوكول تجريبي وسير عمل تحليل البيانات لأداء الخلية الحية المزدوجة اللون مضان عبر التحليل الطيفي الارتباط (FCCS) جنبا إلى جنب مع Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) لدراسة ديناميات مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية باستخدام تقنيات وضع العلامات الفلورية الحديثة.
Abstract
نحن نقدم بروتوكول وسير العمل لأداء الخلية الحية المزدوجة اللون مضان عبر الارتباط الطيفي (FCCS) جنبا إلى جنب مع Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) لدراسة ديناميات مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية باستخدام تقنيات وضع العلامات الفلورية الحديثة. في FCCS ثنائي اللون ، حيث تمثل التقلبات في كثافة الفلورسينس “بصمة” ديناميكية للجزيئ الحيوي الفلوري المعني ، يمكننا التحقيق في الانتشار المشترك أو الربط بين المستقبلات. FRET، مع حساسيتها العالية للمسافات الجزيئية، بمثابة “نانورولر” معروفة لرصد التغيرات داخل الجزيئية. وإذا ما أخذت معا، فإن التغيرات التنظيمية والمعلمات الرئيسية مثل تركيزات المستقبلات المحلية وثوابت التنقل تصبح متاحة في البيئات الخلوية.
إن أساليب الفلورسينس الكمية تشكل تحديا في الخلايا بسبب مستويات الضوضاء العالية وضعف العينة. هنا نعرض كيفية إجراء هذه التجربة، بما في ذلك خطوات المعايرة باستخدام اللون المزدوج المسمى β2-مستقبلاتالأدرينالية (β2AR) المسمى مع eGFP وSNAP-tag-TAMRA. يتم توفير إجراء تحليل البيانات خطوة بخطوة باستخدام برامج مفتوحة المصدر وقوالب يسهل تخصيصها.
يمكن دليلنا الباحثين من كشف التفاعلات الجزيئية للجزيئات الحيوية في الخلايا الحية في الموقع مع موثوقية عالية على الرغم من مستويات الإشارة إلى الضوضاء المحدودة في تجارب الخلايا الحية. وتسمح النافذة التشغيلية ل FRET وخاصة FCCS بتركيزات منخفضة بالتحليل الكمي في الظروف شبه الفسيولوجية.
Introduction
التحليل الطيفي الفلوري هو واحد من الطرق الرئيسية لقياس ديناميات البروتين والتفاعلات البروتين البروتين مع الحد الأدنى من الاضطراب في السياق الخلوي. التحليل الطيفي للارتباط الفلوري الكونفوكوكال (FCS) هو واحد من الأساليب القوية لتحليل الديناميات الجزيئية كما هو جزيء واحد حساسة، انتقائية للغاية، ويعيش الخليةمتوافقة 1. بالمقارنة مع النهج الأخرى الموجهة نحو الديناميكيات ، فإن FCS لديها نطاق زمني أوسع قابل للقياس يمتد من ~ ns إلى ~ s ، والأهم من ذلك تغطية المقاييس الزمنية السريعة التي غالبا ما لا يمكن الوصول إليها عن طريق الأساليب القائمة على التصوير. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر أيضا الانتقائية المكانية بحيث يمكن بسهولة تمييز الغشاء، السيتوبلازميك، والنواة الديناميات الجزيئية 2. وهكذا، يمكن تحليل الوميض الجزيئي ومتوسط التركيز المحلي ومعامل الانتشار كميا باستخدام FCS. الديناميات بين الجزيئية مثل الربط تصبح سهلة الوصول إليها عند التحقيق في الانتشار المشترك لنوعين الجزيئية في التحليل الطيفي عبر الارتباط الفلوري (FCCS)تحليل 3،4،5 في نهج ثنائي اللون.
المبدأ الأساسي الأساسي في التحليل الطيفي للارتباط هو التحليل الإحصائي لتقلبات الكثافة المنبعثة من الجزيئات الحيوية المسماة الفلورية المنتشرة داخل وخارج تركيز الليزر(الشكل 1A). يمكن بعد ذلك تحليل وظائف الارتباط التلقائي أو المتبادل الناتجة عن ذلك عن طريق منحنى مناسب لاشتقاق ثوابت معدل الفائدة في نهاية المطاف. وبعبارة أخرى، فإن الأساليب الإحصائية FCS و FCCS لا توفر آثار جزيء واحد كما هو الحال في تتبع الجسيمات واحد، ولكن نمط ديناميكي أو “بصمة” عينة التحقيق مع دقة زمنية عالية. عندما يقترن Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) ، يمكن رصد الديناميات داخل الجزيئية مثل التغيرات تشكيلية في نفس الوقت في الإعداد confocalالمشتركة 5،6. FRET تحقيقات المسافة من اثنين من الفلوروفوريس وغالبا ما يشار إليها باسم الجزيئية “nanoruler”. ولا يحدث نقل الطاقة إلا عندما تكون الجزيئات في محيط قريب (< 10 نانومتر)، ويتداخل طيف انبعاثات المتبرع بشكل كبير مع طيف امتصاص جزيء المقبول، ويوازي اتجاه ثنائي القطب للمتبرع والمتقبل (بما فيه الكفاية). وهكذا ، فإن الجمع بين FRET و FCCS يوفر تقنية ذات دقة زمنية عالية جدا. عندما الانتقائية المكانية، والحساسية، فضلا عن التوافق بين الخلايا الحية مطلوب، FRET-FCCS لديه مفيد واضح على أساليب أخرى مثل قياس حرارية المعايرة Isothermal (ITC)7،سطح بلازمون الرنين (SPR)8،أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR)9،10 لقياس ديناميات البروتين والتفاعلات.
على الرغم من قدرات ووعد مزدوج اللون مضان عبر الارتباط الطيفي (DC-FCCS)، أداء DC-FCCS في الخلايا الحية هو التحدي من الناحية الفنية بسبب نزيف الطيفية من خلال أو عبر الحديث بين القنوات3،4، والفرق في أحجام confocal بسبب خطوط الليزر متميزة طيفيا3،4،11، إشارة الخلفية ، والضوضاء أو القدرة الضوئية المحدودة للعينات12، 13،14،15. وكان إدخال الإثارة النبض interleaved (PIE) ل FCCS قرص مهم لفصل زمنيا الإثارة الليزر المختلفة للحد من الكلام الطيفي بين القنوات16. طرق التصحيح الأخرى لمواجهة النزيف الطيفي من خلال17،18،19 وتصحيحات الخلفية كما تم قبولها جيدا17،18،19. للحصول على تفاصيل وأساسيات على FCS، PIE أو FRET القارئ يشار إلى المراجع التالية2،4،6،16،20،21،22،23،24.
هنا، يتم تقديم جميع تجارب المعايرة اللازمة والتحليل جنبا إلى جنب مع النتائج التجريبية لمستقبلات G-البروتين إلى جانب نموذجي، β2-مستقبلات الأدرينالين (β2AR)، لثلاثة سيناريوهات مختلفة: (1) جزيئات ذات تسمية واحدة تحمل إما “الأخضر” (eGFP) أو “الأحمر” (SNAP-tag القائم على وضع العلامات)25 الفلوروفور؛ (2) بناء مزدوج المسمى، الذي يحمل علامة SNAP-محطة N وeGFP داخل الخلايا (NT-SNAP) [في هذه الحالة، كل التسميات هي في نفس البروتين. وبالتالي من المتوقع 100٪ نشر مشترك]؛ و (3) عينة مزدوجة التسمية، حيث يكون كلا الفلوروفوريس على نفس الجانب من غشاء الخلية (CT-SNAP). وهو يحمل علامة SNAP-TERMINAL C وeGFP داخل الخلايا. هنا، مرة أخرى كل التسميات هي في نفس البروتين مع مرة أخرى 100٪ المشاركة في الانتشار المتوقع. كما كل التسميات هي قريبة جدا من بعضها البعض، على نفس الجانب من غشاء الخلية، فإنه يظهر القدرة على مراقبة FRET والسلوك المضادة للارتهان. تم تحويل جميع المنشآت المصابة في خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) ووصفت في وقت لاحق مع ركيزة الفلورسنت الحمراء التي هي غشاء غير منفذة لبناء NT-SNAP والغشاء نفاذية لبناء CT-SNAP. وأخيرا، فإن البيانات المحاكاة تجسد تأثير المعلمات التجريبية على مضاد الارتباط الناجم عن FRET، وتأثير التفاعلات بين البروتين والبروتين على اتساع الانتشار المشترك.
وهكذا، يوفر هذا البروتوكول دليلا كاملا لأداء FRET-FCCS مجتمعة في الخلايا الحية لفهم ديناميات البروتين والتفاعلات البروتين البروتين مع جعل على بينة من التحف التقنية / المادية، والتحديات، والحلول الممكنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح تقنيات FCS في GPCRs بتقييم حركة وتفاعلات المستقبلات داخل الخلايا الحية41. وميزة تقنية FRET-FCS هي أنه، إلى جانب التنقل، يمكن التحقيق في الديناميات التوافقية ل GPCRs. ومع ذلك ، فإن أداء FRET-FCS في الخلايا الحية أمر صعب ويتطلب الخلايا التي تظهر تعبيرا منخفضا (أو معتدلا إلى أقصى حد) عن البروتين المسمى بالفلورسنت المثير للاهتمام والإعداد الجيد وخطوط أنابيب جيدة لتحليل البيانات. هنا، أولا، تناقش النقاط الحرجة في إعداد العينات والإجراءات التجريبية فيما يتعلق بالنقاط البيولوجية والتحليلية والتقنية.
وتشمل الخطوات التجريبية الحاسمة التقليل إلى أدنى حد من الخلفية والفلورية التلقائية (باستخدام الأغطية النظيفة على نطاق واسع والوسائط الحرة الفينول الحمراء)، وتحسين ظروف العدوى (على سبيل المثال، كمية الحمض النووي البلازميد والوقت بعد العدوى) لتحقيق مستويات التعبير المنخفضة ووضع العلامات الفعالة. وبطبيعة الحال، من الضروري أيضا ضمان عدم إعاقة وظيفة البروتين المسمى. وهكذا، في تجارب الخلايا الحية، وغالبا ما يتخذ القرار لوضع العلامات الاستراتيجية ووضع التسمية لصالح البروتينات الفلورية أو SNAP / CLIP العلامة المرفقة مرنة N- أو C-terminus42،43. استراتيجيات وضع العلامات البديلة مثل إدراج حمض أميني غير طبيعي مع سلسلة جانبية تفاعلية لوضع العلامات مع الفلوروفور العضوي قد ظهرت في السنوات الأخيرة44.
بالنسبة ل PIE-FCS ثنائي اللون ، حيث لا يتم التحقيق إلا في تفاعل جزيئين مثيرين للاهتمام ، يمكن اختيار الفلوروفوريس من بين مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات الفلورية الراسخة أو ركائز SNAP / CLIP. هنا ، يجب أن يكون الهدف من التحليل الطيفي هو اختيار زوج بحيث يحدث القليل من الكلام المتقاطع أو الإثارة المقبولة المباشرة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون الفلوروفوريس المختارة قابلة للصور وتظهر القليل من التبييض أو لا تظهر على أي حال في ظل الظروف التجريبية المختارة. فمن المستحسن لتحديد الفلوروفوريس في النطاق الطيفي الأحمر كما (1) يتم تقليل الخلفية autofluorescence من الخلية و (2) ضوء الإثارة هو من الطول الموجي أطول، وبالتالي أقل فوتولوكسيك14. يمكن تقليل photobleaching عن طريق إجراء ما يسمى “سلسلة الطاقة” أولا ، حيث يتم زيادة قوة الليزر تدريجيا ، ويلاحظ السطوع الجزيئي. تكمن مجموعة كثافة الإثارة المثلى في النطاق الخطي للنتائج45.
إذا كان من المفترض أن التسميتين للإبلاغ أيضا عن ديناميات تشكيل البروتين من خلال FRET ثم اختيار الفلوروفوريس المتاحة هو أكثر تقييدا. هنا، ينبغي تقدير المسافة الدنيا/القصوى الممكنة بين الفلورين مسبقا، على سبيل المثال، استنادا إلى الهياكل المتاحة أو الحجم الجزيئي، وزوج الفلوروفور الذي تم اختياره بنصف قطر Förster R 0 المعقول بحيث يمكن أن يحدث FRET فعليا20.
هنا ، تم اختيار eGFP وعلامة SNAP للتسمية ، وتم تسمية علامة SNAP إما بركيزة سطحية داخل الخلايا أو ركيزة سطحية غير منفذة للغشاء. الأطياف مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 2C-D. يظهر هذا المزيج من الفلوروفوريس التحدث المتبادل العالي ل eGFP في قنوات الكشف الحمراء والإثارة المقبولة المباشرة للركيزة SNAP بواسطة الإثارة الخضراء في النافذة الزمنية الفورية ويؤدي إلى إشارة “كاذبة” كبيرة في القنوات الحمراء في النافذة الزمنية الفورية. من الناحية المثالية ، يجب ألا تتجاوز القيمتين ، والكلام المتبادل والإثارة المقبولة المباشرة ، 5٪5،6،38. ومع ذلك ، مع دائرة نصف قطرها Förster من 57 Å ، فمن المناسب بشكل مثالي للتحقيق في المسافة بين التسميات في β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP بناء كما يمكن تقييمها من عمر eGFP مروي (ملاحظة التكميلية 5).
من الناحية الفنية ، كما هو الحال بالنسبة لأي تجربة مطيافية مضانة ، يجب أن يكون الجهاز متوافقا بشكل جيد ويجب أن يمتلك مصادر إثارة مناسبة ، ومرشح انبعاثات ، وأجهزة كشف حساسة. لتجنب القطع الأثرية من كاشف بعد الضخ على مقياس الوقت μs، يجب أن يكون هناك كاشفان على الأقل من كل لون، والتي يمكن ربطها. في الوقت الحديث المرتبطة فوتون واحد عد الالكترونيات ، والوقت الميت من بطاقة الكشف في النطاق الزمني NS لا يكاد يلعب دورا بسبب قنوات التوجيه المستقلة ، ومع ذلك ، فإنه قد يتم التحقق من ذلك على النحو المقترح من قبل مولر وآخرون 16 شريطة أن النطاق الزمني للاهتمام يكمن في النطاق الزمني sub-μs / ns. بالإضافة إلى ذلك، حتى لقرارات وقت أعلى في نطاق PS، ينبغي مضاعفة كل قناة الكشف، أي أربعة كاشفات لكل لون ينبغي استخدامها، لتجاوز أيضا كاشف الميت مرات2،15،29،46. وفي حين يمكن تقدير متوسط عمر الفلورسين باستخدام الكشف عن الفلورسينس غير المستقطب، يتعين جمع الانبعاثات المعتمدة على الاستقطاب لتحليل المسافة (~التوزيع) بين الفلوروفوريس. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كفاءة نقل الطاقة في FRET تعتمد على اتجاه الفلوروفورين. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات التفصيلية هنا20،28،47. وأخيرا، في تجارب PIE، المسافة بين نبضة المطالبات والتأخير حرجة وينبغي اختيارها بحيث تتحلل كثافة الفلورية للفلوروفوريس إلى حد كبير(الشكل 1B). القاعدة الشائعة هي وضع النبضات 5x عمر الفلورسينس بعيدا ، أي بالنسبة ل eGFP مع عمر مضان قدره 2.5 ns يجب أن تكون المسافة 12.5 ns بحد أدنى22.
بعد أن تم تفصيل جميع الاعتبارات للإجراء التجريبي ، تتم مناقشة البيانات وتحليلها بمزيد من التفصيل. كما هو مذكور في قسم البروتوكول، يجب التحقق من محاذاة الإعداد يوميا، بما في ذلك تحليل قياسات المعايرة. وتظهر البيانات المبينة في الشكل 2 ألف– جيم مثلا عنصرا إضافيا للاسترخاء في نطاق 8-40 ميكروس. ومن المعروف أن الوميض الثلاثي النموذجي للمضايرة الخضراء يحدث في نطاق 2-10 ميكروس13،15،48. عنصر الاسترخاء البطيء المطلوب في جميع منحنيات عينة الحمض النووي(الشكل 3C)،بطيئ جدا للوميض الثلاثي الفعلي، قد ينبع من تفاعلات الحمض النووي مع الفلوروفوريس39. ومع ذلك، لن يتوقع هذا المكون في CCFPIE، وينبع على الأرجح من الكلام المتبادل المتبقي. وبالتالي ، فإنه من المستحسن للغاية لإجراء تحليل عينات المعايرة مباشرة قبل الشروع في تجارب الخلية للحكم على نوعية المحاذاة اليوم.
تتطلب المعايرة المناسبة لحجم التداخل البؤري عينة مع نشر مشترك بنسبة 100٪ للتسمية الخضراء والحمراء. هنا، يتم استخدام الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل المسمى بالفلورسنت. يمكن تصميم كلا خيوط الحمض النووي ليكون الفلوروفوريس المطلوب على المسافة المطلوبة من بعضها البعض. يمكن أن تكون خيوط مصممة مع ارتفاع العائد. ومع ذلك ، تنصح الممارسة المختبرية الجيدة بالتحقق من سلامة ودرجة وضع العلامات على خيوط الحمض النووي عن طريق إلكتروفورسيس هلام الآغروز وقياس طيف الامتصاص. أيضا، يجب التحقق من العائد من التجميع المزدوج تقطعت بهم السبل كما قياس المعايرة هذا يعتمد بشكل حاسم على افتراض أن هناك 100٪ نشر مشترك من الأخضر مع التسمية الحمراء. في حالة افتراض غير صالح، قد يكون من الضروري تطبيق عوامل التصحيح16،22. في قياسات المعايرة المبينة في الشكل 2 والشكل 3،تم الحصول على حجم كشف قدره 1.4 fL و 1.9 fL في القناة الخضراء والحمراء، على التوالي. ومن المتوقع هذا الفرق حجم لإعداد مع وحدات التخزين الإثارة الحيود محدودة تقريبا (ملاحظة التكميلية 2). في ظل هذه الحالة ، حجم حجم الإثارة المقاييس مع الطول الموجي الإثارة. وهذا بدوره يفسر الاتساعات المختلفة للارتباط الملاحظة في الشكل 3B. عوامل التصحيح المشتقة rGR = 0.56 و rRG = 0.72 الصحيح لهذا التباين حجم وتداخل غير مثالي المحتملة من حجمين الإثارة3،4.
الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6، والشكل 7 عرض سير العمل من PIE – F (C) CS دراسة مقرها تهدف إلى فهم ديناميات البروتين تشكيلية. أولا، يعمل البناءان أحاديا التسمية β2AR-IL3-eGFP وNT-SNAP-β2AR كضوابط لتوصيف خصائص الفلوروفور في الخلايا في غياب الفلوروفوري الأخرى المعنية(الشكل 4). بعد ذلك ، فإن بناء مزدوج المسمى NT – SNAP – β2AR – IL3 – eGFP تحمل SNAP – العلامة التي تواجه الخارجي الخلية وeGFP على الجانب السيتوبلازمي بمثابة “100 ٪ نشر مشترك” السيطرة(الشكل 5). آخر بناء، β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP، يحمل كل من الفلوروفوريس على الجانب السيتوبلازمي وقريبة بما فيه الكفاية معا للخضوع FRET. هنا، مرة أخرى من المتوقع 100٪ نشر مشترك جنبا إلى جنب مع تقلبات كثافة المضادة للارتباط في إشارة القنوات الخضراء والحمراء في نافذة الوقت الفوري، أي بعد الإثارة المانحة، وذلك بسبب ديناميات البروتين التأثير على كفاءة FRET31،32،33. قد تظهر هذه الديناميكيات كمكافحة الارتباط في CCFFRET (الشكل 6-7).
جميع GPCR β2AR يبني تظهر انتشار ثنائي الوسائط على غشاء الخلية(الشكل 4A). في حين أن β2AR-IL3-eGFP يظهر فقط الوميض الثلاثي المتوقع(الشكل 5B)13،15، NT-SNAP-β2AR يظهر وقت استرخاء بطيء إضافي(الشكل 5C-D). ومن المرجح أن TR2 قد تنبع من ركيزة SNAP غير منضمة. ويمكن توضيح ذلك من خلال إجراء المزيد من التجارب، على سبيل المثال، من خلال قياس الانتشار والخصائص الفيزيائية الضوئية للركيزة SNAP المستخدمة في محلول مائي. وتجدر الإشارة إلى أن التجربة المباشرة للتمييز بين أوقات الانتشار والاسترخاء هي تغيير الثقب في الإعداد الكونفوجال ، أي زيادة الحجم الفعال: في حين أن أوقات الانتشار تزداد مع زيادة الأحجام الفعالة ، فإن شروط الاسترخاء لا تتغير13. عند تحديد تركيز البروتين الفلوري (FP) على أساس النتائج المناسبة ، كن على علم بأن FPs بشكل عام يخضع لعملية نضوج ، والتي يتم فيها تشكيل الكروموفوري في النهاية12. قد يختلف وقت النضج هذا من FP إلى FP بالإضافة إلى الفيزياء الضوئية التي تعتمد على البيئة الكيميائية المحلية13،15. وبالتالي، فإن تركيز البروتين الفعلي الموجود في العينة التي أبلغ عنها FCS عادة ما يتم الاستهانة به، والذي يمكن تصحيحه إذا كان يمكن تحديد جزء من FPs غير الفلورية في التجربة. وأخيرا، فإنه من المستحسن للتحقق من أطياف الفلوروفور في الخلايا الحية لتصحيح القيم α δ، إذا لزم الأمر، كما يتفاعل معظم الفلوروفوريس حساسة لبيئتهم13،15،48. يتم تحديد الخلفية للطرح بواسطة الإشارة التي تم جمعها في الخلايا غير المصابة. بالإضافة إلى ذلك، يجب التحقق من الارتباط التلقائي للقناة اللونية الأخرى المعنية و PIE CCF لتكون قادرة على تحديد إشاراتخاطئة (ملاحظة تكميلية 4 – الشكل 30).
تمالحصولعلى القياسين من NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP(الشكل 5D)،حيث تقع الفلوروفورات على جوانب مختلفة من الغشاء، في أيام مختلفة ويظهر أهمية الإحصاءات في مضان جزيء واحد حل الوقت. هنا، قد تكون النتائج المختلفة بسبب اختلاف درجة وضع العلامات: في خلية واحدة أدت الدرجة العليا من وضع العلامات ومتوسط القياسات إلى ضوضاء منخفضة نسبيا(الشكل 5B)،بينما من الخلية الأخرى، يمكن جمع قياسين فقط(الشكل 5A). بالإضافة إلى جمع كمية كافية من البيانات، من الضروري تقييم النتائج في الوقت المناسب، وربما تحسين استراتيجية وضع العلامات. عند تصميم التجارب، من المهم أن نتذكر أن FRET حساسة، ولكن تقتصر على مسافات تصل إلى 10 نانومتر و “أعمى” خلاف ذلك. في حالتنا ، يشار إلى هذا “العمى” من خلال عمر الفلورية eGFP دون تغيير (الملاحظة التكميلية 5). في β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP بناء(الشكل 6A)،يمكن تحديد FRET من العمر eGFP مروي (ملاحظة التكميلية 5). ومع ذلك، لا يلاحظ مصطلح مكافحة الترابط(الشكل 6B)،مما يعني أن FRET إما لا تتقلب أو على مقياس زمني أبطأ من وقت الانتشار. مطلوب ما يصل إلى ثلاثة شروط إضافية للاسترخاء في سباق الجائزة الكبرىACF، ACFRP، ACFRD و CCFFRET (الشكل 6C). قد يكون العنصر البطيء في ACFRPو ACFrd و CCFFRET بسبب تبييض المقبول ، وبطبيعة الحال ، يؤثر على القيمة التي تم الحصول عليها من الانتشار البطيء الموجود في هذه المنحنيات (~ 350 مللي ثانية مقارنة ب 117 مللي ثانية في سباق الجائزةالكبرىACF). TD في القناة الحمراء من المفترض أن تكون أكبر قليلا مما كانت عليه في القناة الخضراء بسبب أحجام confocal مختلفة الحجم (الشكل 2) – ولكن فقط من قبل عامل مماثل لفارق الحجم. وقت الاسترخاء سريع جدا من 3 μs يعكس ثلاثية وامض من الفلوروفوريس13،15،48، في حين أن وقت الاسترخاء أبطأ من 37 ميكرومتر قد يكون بسبب FRET : وبالمثل ، كما FRET يحفز anticorrelation في FRETCCF، ومن المتوقع الارتباطات الإيجابية في autocorrelations31،32،33. ويمكن تفسير وجود هذا المصطلح بأنه “إيجابي” في إطار التعاونالقطري المشترك ووجوده في إطار التعاون الإقليمي بالحضور المتبادل العالي وينبغي توضيحه أكثر. لاحظ أن CCFPIE مسطح في أوقات الارتباط قصيرة كما هو متوقع.
من ناحية أخرى ، تجدر الإشارة إلى أن حدوث FRET في نظام المصالح يؤدي إلى آثار غير خطية على منحنيات الارتباط6. السطوع الجزيئي على سبيل المثال ، من جداول جزيء في اتساع الارتباط التربيعية وكل FRET الدولة (والجزيئات الموجودة دائما دون مستقبلات نشطة) يظهر سطوع الجزيئية المختلفة. في الواقع ، FRET يقلل من التركيز الظاهر للجزيئات الخضراء المكتشفة (أي يزيد من سعة سباق الجائزة الكبرى ACF) وعدد الجزيئات الحمراء (التي تحدد من الأحمر الفوري) مبالغ فيه5. كلا التأثيرين تؤثر على مقدار التفاعل المستمدة من كل من CCFFRET و CCFPIE. ومع ذلك، يمكن للتحليل العالمي كما هو مبين على سبيل المثال للديناميات داخل الجزيئية من كالمودولين 31،32 أو Syntaxin33 تكشف عن ديناميات البروتين. عند معايرة بعناية، يمكن استخراج متوسط كفاءة FRET من السعة النسبية CCFPIE و ACF22،في حين يمكن تحديد الدول المقيدة من تحليل توزيع العمر الفلوري المانح33.
وبالنظر إلى حقيقة أنه في تجارب الخلايا الحية مع الفلوروفوريس الكبيرة مثل eGFP من المرجح أن يكون تباين FRET أقل من المفترض للمحاكاة الموضحة في الشكل 6 وأن الإثارة المباشرة للمقبول لم تتم إضافتها في المحاكاة ، قد يفسر لماذا تحديد مضاد الترابط في تجارب الخلايا الحية أمر صعب للغاية. بديل تحليل واعد يعتمد على حصاد المعلومات المشفرة في المدرجات التكرارية وقت وصول الفوتون(الشكل 1B)يمكن الوصول إليها بسبب الوقت المترابط الفوتون واحد عد جمع البيانات29،30. إذا كان عمر الفلورسينس (~patterns) لنوعين (أو أكثر) (FRET) داخل العينة معروفين (الشكل 7A) ، يمكن اختيار “فلتر” أو أوزان يتم تطبيقها أثناء عملية الارتباط (الشكل 7B)17،18،19. وهكذا فإن منحنيات الارتباط التي تم الحصول عليها، لم تعد تمثل ارتباط قنوات الكشف، بل تمثل الارتباطات التلقائية أو المتبادلة بين نوعين مختلفين (FRET)، وبالتالي أعيدت تسميتهما إلى الأنواع -ACF (sACF) أو الأنواع-CCF (sCCF). تطبيق هذا النهج على البيانات محاكاة مع التباين FRET معتدلة، وارتفاع التحدث المتبادل وامض الثلاثي يستعيد مصطلح مكافحة العلاقة(الشكل 7C-D). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن الحصول على أوقات الاسترخاء ولكن يتم فقدان العلاقة مع السعة18. وقد تم تطبيق هذا النهج سابقا في تجارب الخلايا الحية على سبيل المثال لدراسة تفاعل EGFR مع خصمها49 أو لفصل الفلورسينس من البروتينات المرفقة بمتغيرات eGFP مع عمر مضان قصير وطويل بشكل استثنائي50.
في حين تستخدم قياسات FRET المستندة إلى PIE في البروتينات النقية إلى حد كبيرلدراسة ديناميكيات البروتين 3622، في الخلايا الحية ، فإنها تركز على فهم التفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد تم تطبيق هذا النهج لدراسة تنظيم نشاط كيناز MAP في الخميرة51 أو لحل تفاعل بروتينات الأغشية مع شريكها ملزمة السيتوسوليك كما هو ملخص في هذه المادة الأخيرة52. هنا، قد تنشأ مضاعفات عندما لا يزال هناك حديث متقاطع كبير من الفلوروفوريس الأخضر في نافذة وقت التأخير للقنوات الحمراء أو الإشارة الحمراء في القنوات الخضراء في النافذة الزمنية الفورية. وقد يكون السبب الأول هو التأخير غير الكافي للنبض الأحمر فيما يتعلق بالنبض الأخضر في حين أن كلا التأثيرين ينبعان من تداخل شديد في الإثارة وأطياف الانبعاثات للفلوروفوريس المختار. فمن المستحسن للتحقق من كل واحد المسمى يبني بعناية والصحيح لاتساع CCFPIE إيجابية كاذبة، وخاصة في الخلايا حيث autofluorescence مع عمر مضان قصيرة جدا قد يكون عاملا آخر تعقيد22.
في الختام، فإن نهج FRET-FCS الموصوف هنا لديه إمكانات كبيرة لفهم التفاعلات البروتينية البروتينية وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية بتركيزات فسيولوجية قريبة. وفي هذا البروتوكول، تم التركيز على قياسات المعايرة المطلوبة والتحليل الكمي اللازم الذي يتعين إجراؤه أثناء قياسات الخلايا الحية. وتحقيقا لهذه الغاية، عرضت قياسات مختلفة للخلايا الحية تكملها عمليات محاكاة. وتوفر عمليات المحاكاة الفهم العام هنا حيث يمكن أن تختلف المعلمة بشكل منهجي مع نماذج تناسب المصممة خصيصا التي تصف التنقل المحدد والخصائص الفيزيائية الضوئية للبيانات المعنية. وقد تم إجراء التحليل باستخدام أدوات برمجيات مفتوحة المصدر مع بروتوكول شامل خطوة بخطوة وقوالب سهلة التكيف. وأخيرا، فإن التقدم التقني، وبالتالي توافر أنظمة PIE-FCS المستقرة الجاهزة للشراء إلى جانب انتشار البرمجيات مفتوحة المصدر لتحليل البيانات، سيجعل هذه التقنية أكثر سهولة لمجتمع بحثي أكبر لكشف تفاعل البروتين وديناميكياته في الخلايا الحية ذات الحساسية القصوى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240، رقم المشروع 374031971، مشروع INF) إلى J.B وK.G.H.
نشكر مركز رودولف فيرتشو على الدعم المالي والتصوير الفلوري للوحدة الأساسية على الدعم الفني. بالإضافة إلى ذلك، نشكر أشوين بالاكريشنان على قراءة الأدلة الشاملة.
Materials
| 1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
| 2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
| 2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
| 6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
| Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
| ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
| Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
| Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
| Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
| Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
| Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
| ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
| DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
| DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
| Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
| Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
| Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
| Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
| Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
| Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
| Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
| Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
| MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
| Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
| Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
| Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
| Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
| Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
| PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
| Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
| Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
| Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
| SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
| Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
| Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |
References
- Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
- Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
- Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
- Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS–friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
- Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
- Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
- Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
- Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
- Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
- Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
- Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
- Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -. J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
- Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
- Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
- Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
- Thompson, N. L., Lakowicz, J. R. . Topics in Fluorescence Spectroscopy. , 337-378 (1991).
- Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
- Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
- Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
- Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
- Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
- Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
- Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
- Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
- Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
- Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
- Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
- Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
- Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
- Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
- Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
- Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
- Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
- Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
- Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
- Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
- Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
- Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).
