İskemi Reperfüzyonu Sonrası Dijital Makro Fotoğrafçılık için Kemirgen Kalp ve Beyin Dokusu Hazırlığı

IR sonrası kalbin hazırlanması, kan kardiyak arterlerinin yeniden tıkanması ve risk altındaki alanların risk altındaki bölgelerden ayrılması için mavi boyanın perfüzyonu ile başlar. Metilen mavisi veya Evans mavisi boyalar bu amaçla en sık ^{kullanılır2}. Aşırı yüksek bir basınç kalp kapakçıklarına zarar verebileceğinden ve dolayısıyla risk altındaki alanları kısmen veya tamamen lekeleyebileceğinden, kalbi Langendorff aparatı veya hidrostatik basınç sistemi donanımlı bir şırınga veya pompanın basitleştirilmiş bir versiyonu gibi basınç kontrollü bir sistemle delmek daha iyidir. Kontrollü perfüzyon fizyolojik basıncı sağlayacak ve boya genellikle kalbin tıkalı bölgesine girmeyecektir. Hem akış hızı hem de basınç kontrollü teknikler aşırı boyanmaya karşı koruma sağlar.

Canlı doku işlemedeki en ciddi hatalardan biri, dokuları lekelemeden önce uzun süre dondurucuda tutmaktır. Donma esas olarak kullanılır çünkü araştırmacılar IR deneyinden sonraki gün veya daha sonra kalp boyama yapmak isterler. Ayrıca, kalbin kesilmesini kolaylaştırmak için dondurma kullanılır. Kalbin 5-10 dakikaya kadar kısa süreli donmasının ihmalkar bir şekilde kalp dokularının bütünlüğünü etkilediğini ve dokuların (özellikle fare kalpleri için) ince dilimler halinde kesilmesini kolaylaştırdığını bulduk. Bununla birlikte, uzun süre dondurma membranlara zarar verir ve hücre canlılığını ve mitokondriyal fonksiyonu ^azaltır13. Sonuç olarak, işleyen mitokondrinin TTC boyaması etkilenir ve nekrotik ve canlı dokular arasındaki sınır zayıf bir şekilde tanımlanmıştır (bulanık). Genel olarak, sıçan osuruklarının dondurulmasından kaçınılmalıdır ve daha kolay kesim için fare kalplerinin sadece kısa süreli dondurulması kullanılabilir.

Bir sonraki adım, 37 ° ^C14’te% 1 TTC çözeltisinde doku boyamasıdır. Boyama çözeltisi önceden ısıtılmalıdır – özellikle beyin dilimlerinin boyanması için önemlidir. Önceden ısıtılmış çözeltiyi kullanırken, kalp dilimleri için en uygun boyama süresi 10 dakikadır. Daha uzun bir inkübasyon veya 37 ° C’den daha yüksek bir sıcaklık, kalp dokularının kahverengi renklenmesine neden olur. Numunelerin uygun şekilde boyanması ve tutarlı kırmızı renk yoğunluğu, daha ileri görüntü analizi için önemlidir. Fotoğraftan önceki son adımlarda, doku dilimleri soğuk PBS veya benzeri bir tamponla 2-3 kez durulanarak TTC ve fazla metilen mavisini çözeltiden uzaklaştırarak fotoğrafta mavi dökümü önler. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için kalp dilimleri lekelenmeden kısa bir süre sonra fotoğraflanmalıdır. Kalp boyaması, soğukta (+4 ° C) PBS’de 60 dakikaya kadar saklanırsa iyi kalitede kalır. Lekeli beyin dilimleri ve aort dokuları genellikle% 4’lük nötr bir formaldehit çözeltisinde depolanır ve bir hafta boyunca iyi kaliteyi korur. Beyin dokularının formalin (+4 °C) içinde gece boyunca depolanması, normal dokunun renk yoğunluğunu bozmaz ve görüntü elde etmek için kabul edilebilir. Bununla birlikte, formalin kalp dilimlerinin şişmesine ve lekelenmesine neden olur. Bu nedenle, kalp dokularının formalinde depolanması önerilmez.

Bir sonraki adım görüntü yakalamadır. Birçok laboratuvar, düz yataklı tarayıcıları, dijital kamera ve aydınlatma kurulumunun yerini alması beklenen bir görüntü yakalama aracı olarak kullanır. Dilimlerin taranmasının yeterli görüntü çözünürlüğü ve renk ayrımı sağlamadığını ve bu nedenle kalp dilimlerinin görüntülenmesi için uygun olmadığını belirledik. Özellikle, tarayıcı çözünürlüğü fare kalpleri için yetersizdir ve metilen mavisinin zayıf bir şekilde oluşturulduğunu fark ettik. Buna karşılık, bir tarayıcı, yalnızca TTC veya diğer tek boyalarla boyanmış beyin dilimlerini görüntülemek için bir fotoğraf kamerasına alternatif olabilir. Doku dilimlerinin taranması için, sürekli pozlama ayarlarını sağlayan tarama yazılımı gereklidir. Genel olarak, düz yataklı bir tarayıcı daha az yeteneklidir ve çoğu görüntüleme uygulaması için dijital kameranın yerini alamaz.

Örneklerin arkasındaki arka plan da önemlidir. İdeal olarak, tepsinin tabanı lekeli numunede bulunmayan bir renkte olmalıdır. Örneğin, metilen mavisi ve TTC (kırmızı) boyama alanını otomatik veya yarı otomatik bir şekilde ölçmek için beyaz, kırmızı, mavi, sarı ve kahverengi arka planlardan kaçınılmalıdır. Bu nedenle, yeşil bir arka plan tercih edilir. Bununla birlikte, renk seçimi, görüntüyü sonradan işleyen operatörün tercihlerine bağlıdır. Birçok bilim adamı beyaz bir arka planı tercih eder, çünkü beyaz bir arka plan görüntü son işlemede silinebilir ve tamamen beyaza dönüştürülebilir (RGB beyaz kodu 255.255.255). Daha sonra, yarı otomatik analiz için kullanılan seçilen renkler listesinden tamamen beyaz hariç tutulmalı ve aşırı pozlanmamışsa tamamen beyaz olmayan soluk nekrotik alanlar sayılmalıdır. Mavi ve yeşil arka planlar beyin dilimlerinin ve aortların fotoğrafçılığı için uygundur.

Doku fotoğrafçılığı için en uygun görüntüleme aracı, uyumlu bir makro lense sahip tek lensli refleks veya aynasız değiştirilebilir lensli dijital fotoğraf makinesidir. Çok küçük nesneleri yakalamak için kamera ve mikroskop kombinasyonu gerekebilir; Bununla birlikte, bir makro lens genellikle fare kalbinin ayrıntılı görüntülerini elde etmek için yeterli (en az 1: 2) büyütmeye sahiptir. Birçok üretici, yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütmeli fotoğraflar elde etmek için uygun fiyatlı dijital kameralar ve makro lensler sunmaktadır. Tüm güncel dijital fotoğraf makineleri, bir standa monte etme imkanı, çok sayıda piksel (genellikle >20 Mpx), canlı görüntü, ayna kilitleme, hızlandırılmış özellikler, uzaktan deklanşör ve kamera parametrelerini manuel olarak ayarlama yeteneği de dahil olmak üzere makro fotoğrafçılık için gerekli özelliklere ve işlevlere sahiptir, böylece sabit bir enstantane hızı, diyafram, beyaz dengesi ve ISO ayarı sağlar. Yukarıda belirtilen özelliklere ve en az 1:2 lens büyütme oranına sahip kompakt fotoğraf makineleri makro fotoğrafçılık için de kullanılabilir. Lens özellikleri nedeniyle, bazı kompakt kameralar nesneye yakın bir yere yerleştirilmeli ve deneyci, kamera gövdesinin numunenin aydınlatmasını etkilemediğinden emin olmalıdır.

Her türlü değiştirilebilir lensli fotoğraf makinesi ile makro fotoğrafçılık için, yüksek büyütmeli (1:1-1:2) makro lens gereklidir. Tam çerçeve (24 mm x 36 mm) sensörde 50 mm ile 100 (120) mm arasında veya eşdeğeri odak uzaklığına sahip makro lensler kullanmanızı öneririz. Daha küçük sensörlü kameralar farklı sensör boyutlarına sahiptir ve büyütme buna göre yeniden hesaplanmalıdır. Kalp dilimlerinin fotoğraflanması için, 100 mm makro lens ön elemanının nesneye ergonomik mesafesi yaklaşık 150 mm’dir. Bu ayar, operatörlerin kamera kontrollerine kolay erişim ile tüm ekipmanı bir masada tutmasına olanak tanır. Beyin dilimleri gibi daha büyük nesnelerin fotoğraflanması için 50 mm’lik bir makro lens düşünülebilir, çünkü tek bir fotoğraftaki tüm dilimleri elde etmek için daha geniş bir görüş alanı gereklidir.

Yüksek çözünürlükte keskin görüntüler elde etmek için, bir kamera, ışık kurulumuyla birlikte fotoğraf kopyası standı olarak adlandırılan sağlam bir standa monte edilmelidir. Fotoğraf makinesini bir standa ve uzaktan kumandalı (kablolu veya kablosuz) bir tetiğe monte etmek, fotoğraf makinesinin titremesini ortadan kaldırır ve hedeften sabit bir mesafe sağlar. Her iki taraftan iki sabit ışık kaynağına sahip, konu düzlemine göre yaklaşık 30-60° açılı bir kamera aydınlatma kurulumu, numunelerin yeterli şekilde aydınlatılmasını sağlar ve aynı zamanda yansımaları önlemeye yardımcı olur. Kamera, sensörün konu düzlemine paralel olması için hassas bir şekilde monte edilmelidir. Görüntü alanını eşit şekilde aydınlatmak için, her iki lamba da eşit şekilde yönlendirilmeli ve nesneden aynı mesafeye yerleştirilmelidir. Nesneden çeşitli mesafelere yerleştirilen ışık kaynakları eşit olmayan aydınlatmaya neden olur. Ek olarak, yanıp sönen ışık kaynakları, görüntü pozlamadaki farklılıkların bir nedenidir. Genel olarak, iyi aydınlatılmış örneklerin görüntülerini hassas bir şekilde elde etmek için kamerayı ve ışık kaynaklarını doğru bir şekilde yerleştirmek önemlidir.

Doku örnekleri, görüntülerde beyaz lekeler olarak görünen ışığı (parıltı) yansıtır. Bu ışık yansıma noktaları yararlı renk bilgileri içermez ve buna bağlı olarak, görüntülerin bu kısımları görüntülerin doğru nicel analizi için kullanılamaz. Doku dilimlerinden gelen ışık yansımaları çeşitli yöntemlerle giderilebilir. En verimli olanı, doku örneklerinin tuzlu su veya PBS çözeltisi içeren bir kaba tam olarak daldırılmasıdır. Benzer bir yaklaşım, cam plakaların altına (veya arasına) doku dilimlerinin yerleştirilmesidir. Bu yöntem yansımalara karşı etkilidir; ancak, görüntü çözünürlüğü daldırılmış dokuların fotoğraflarından daha düşük olabilir.

Işık yansımalarını ortadan kaldırmak için bir lense monte edilmiş polarize edici bir filtre de kullanılabilir. Dairesel polarize filtreler yaygın olarak bulunur, ancak fiyata bağlı olarak kalite açısından önemli ölçüde değişir ve ucuz filtreler görüntü çözünürlüğünü önemli ölçüde azaltabilir. Yansıyan ışık, polarize filtrenin hareketli kısmı bir açıyla döndürülerek filtrelenebilir. Polarize filtrenin etkinliği bazı ışık kaynaklarından (örneğin, güçlü LED ışığı) etkilenebilir. Genel olarak, ekstra sıvının çıkarılmasından sonra, polarize edici bir filtre beyin dilimlerinden gelen tüm yansımaları ortadan kaldırabilir; Bununla birlikte, numunenin tampon çözeltisine daldırılması, kalp dilimleri için en kolay ve en uygun maliyetli yaklaşımdır.

Deklanşör hızı, diyafram açıklığı, ISO ve beyaz dengesinin manuel ayarları, görüntüleme işleminin tam kontrolünü sağlamak için önemlidir. Işık kaynağının örneği, arka planı ve özellikleri, otomatik ayarlarda kamera pozlama ölçüm sistemini etkiler; bu nedenle, deney sırasında birden fazla fotoğraf arasında sabit pozlama ve beyaz dengesini korumak için manuel ayarlar gereklidir. Makro fotoğrafçılık için önerilen diyafram açıklığı ayarı f/8 ile f/16 arasındadır. Diyafram açıklığını azaltarak, alan derinliği artar, bu da nesne tek bir düzlemde değilse yararlıdır. Bununla birlikte, kırınım, daha küçük diyafram açıklıkları durumunda fotoğrafın toplam çözünürlüğünü sınırlar. Çoğu objektif için en uygun diyafram açıklığı genellikle f / 10’dur, çünkü bu ayarda çözünürlük düşüşü ihmal edilebilir ve alan derinliği yeterlidir. 50 ila 400 (daha düşük daha iyidir) arasında değişen ISO değerleri, görüntü yapıtlarını (parazit) en aza indirmek için genellikle en uygunudur. Deklanşör hızı daha sonra mevcut ışık koşullarında belirtilen diyafram açıklığı ve ISO ayarları kullanılarak doğru pozlama elde etmek için değiştirilmeye devam ediyor. Manuel ayarlar, tutarlı görüntü analizi için önemlidir. Standartlaştırılmış görüntüleme, segmentasyon analizi gerektiren herhangi bir etüt boyunca aynı renk eşik ayarlarının kullanılmasını sağlar. Örneğin, ImagePro yazılımı tarafından önceden tanımlanmış mavi, kırmızı ve beyaz (+soluk pembe) renklere sahip bir segmentasyon dosyasına dayalı yarı otomatik analiz, örnek görüntülerin tutarlı renklere, beyaz dengesine ve pozlamaya sahip olması durumunda yıllar içinde kullanılabilir.

Beyaz dengesi ayarı, bir numuneyi aydınlatmak için kullanılan ışık kaynağının renk sıcaklığına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Beyaz dengesi, fotoğraf makinesinin yerleşik ön ayarlarından veya gri bir hedefin manuel kalibrasyonu kullanılarak seçilebilir. RAW formatında görüntü yakalamanın yararı, beyaz dengesinin görüntünün yazılım tarafından işlenmesi sırasında ayarlanabilmesidir. RAW dosyaları JPEG dosyalarından çok daha fazla bilgi içerdiğinden, RAW dosya son işleme, renk dengesi ve pozlamanın düzeltilmesi ve daha iyi görüntü çözünürlüğü elde edilmesi için mükemmel bir fırsat sunar. Çoğu fotoğraf makinesi JPEG ve RAW dosyalarını aynı anda yakalayabildiğinden, RAW dosyasını yakalamanızı ve yedek olarak kaydetmenizi öneririz.

Genel olarak, bu protokol sıçan kalbi ve beyin dokusu dilimleme ve boyama için bir metodolojiyi tanımlar ve daha fazla analiz için yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için aydınlatma ve kamera kurulumları ve fotoğrafçılık teknikleri oluşturmak için kılavuzlar sağlar. Bu yöntem tüm deneysel küçük hayvan organ fotoğrafçılığına uygulanabilir.