Preparación del corazón y el tejido cerebral de roedores para la fotografía macro digital después de la isquemia-reperfusión

La preparación del corazón después de la RI comienza con la reoclusión de las arterias cardíacas sanguíneas y la perfusión de tinte azul para la discriminación de áreas de riesgo de áreas no riesgosas. Los colorantes azul de metileno o azul de Evans se utilizan con mayor frecuencia para este ^propósito2. Como una presión excesivamente alta podría dañar las válvulas cardíacas y, por lo tanto, teñir parcial o completamente las áreas de riesgo, es mejor perfundir el corazón con un sistema controlado por presión, como el aparato Langendorff o una versión simplificada de una jeringa o bomba equipada con un sistema de presión hidrostática. La perfusión controlada asegurará la presión fisiológica, y el tinte generalmente no ingresará a la región ocluida del corazón. Tanto las técnicas de velocidad de flujo como las de control de presión son salvaguardas contra el exceso de tensión.

Uno de los errores más graves en el procesamiento de tejidos viables es mantener los tejidos en un congelador durante un tiempo prolongado antes de la tinción. La congelación se utiliza principalmente porque los investigadores quieren realizar la tinción del corazón el día después del experimento de IR o más tarde. Además, la congelación se utiliza para facilitar el corte del corazón. Se encontró que la congelación a corto plazo del corazón durante un máximo de 5-10 minutos afecta de manera insignificante la integridad de los tejidos cardíacos y facilita el corte de los tejidos (particularmente para los corazones de ratón) en rodajas delgadas. Sin embargo, la congelación durante períodos prolongados daña las membranas y disminuye la viabilidad celular y la función ^{mitocondrial13}. Como resultado, la tinción TTC de las mitocondrias funcionales se ve afectada, y la frontera entre los tejidos necróticos y viables está mal delineada (borrosa). En general, se debe evitar la congelación de los harts de rata, y solo se puede usar la congelación a corto plazo de los corazones de ratón para facilitar el corte.

El siguiente paso es la tinción de tejido en solución de TTC al 1% a 37 °^C14. La solución de tinción debe estar precalentada, particularmente importante para la tinción de cortes cerebrales. Cuando se usa la solución precalentada, el tiempo óptimo de tinción para las rodajas de corazón es de 10 min. Una incubación más larga o una temperatura superior a 37 ° C da como resultado la coloración marrón de los tejidos del corazón. La tinción adecuada de los especímenes y la intensidad constante del color rojo son importantes para un mayor análisis de la imagen. En los pasos finales antes de la fotografía, las rodajas de tejido se enjuagan 2-3 veces con PBS frío o un tampón similar para eliminar el TTC y el exceso de azul de metileno de la solución para evitar la fundición azul en la fotografía. Las rodajas de corazón deben fotografiarse poco después de la tinción para obtener la mejor calidad de imagen. La tinción del corazón permanece de buena calidad si se almacena hasta 60 min en el frío (+4 °C) PBS. Las rebanadas de cerebro teñidas y los tejidos aórticos generalmente se almacenan en una solución de formaldehído neutro al 4% y conservan una buena calidad durante una semana. El almacenamiento nocturno de tejidos cerebrales en formalina (+4 °C) no afecta la intensidad del color del tejido normal y es aceptable para la adquisición de imágenes. Sin embargo, la formalina induce hinchazón y detención de las rebanadas de corazón. Por lo tanto, no se recomienda el almacenamiento de tejidos cardíacos en formalina.

El siguiente paso es la adquisición de imágenes. Muchos laboratorios utilizan escáneres de cama plana como una herramienta de adquisición de imágenes que se espera que reemplace una cámara digital y una configuración de iluminación. Determinamos que el escaneo de cortes no proporciona suficiente resolución de imagen y separación de color y, por lo tanto, no es adecuado para obtener imágenes de cortes de corazón. En particular, la resolución del escáner es insuficiente para los corazones de los ratones, y notamos una mala representación del azul de metileno. Por el contrario, un escáner podría ser una alternativa a una cámara fotográfica para obtener imágenes de cortes cerebrales teñidos solo con TTC u otros tintes individuales. Para el escaneo de cortes de tejido, el software de escaneo que garantiza la configuración de exposición constante es esencial. En general, un escáner de cama plana es menos capaz y no puede reemplazar una cámara digital para la mayoría de las aplicaciones de imágenes.

El fondo detrás de los especímenes también es importante. Idealmente, el fondo de la bandeja debe ser de un color que no esté presente en el espécimen teñido. Por ejemplo, para cuantificar el área de tinción de azul metileno y TTC (rojo) de manera automatizada o semiautomatizada, se deben evitar los fondos blancos, rojos, azules, amarillos y marrones. Por lo tanto, sería preferible un fondo verde. Sin embargo, la selección del color depende de las preferencias del operador, que postprocesa la imagen. Muchos científicos prefieren un fondo blanco porque un fondo blanco se puede eliminar en el postprocesamiento de imágenes y convertirse en completamente blanco (código blanco RGB 255,255,255). Luego, se debe excluir completamente el blanco de la lista de colores seleccionados utilizados para el análisis semiautomatizado y contar solo las áreas necróticas pálidas, que no son completamente blancas si no están sobreexpuestas. Los fondos azules y verdes son adecuados para la fotografía de rodajas cerebrales y aortas.

La herramienta de imagen óptima para la fotografía de tejidos es una cámara digital réflex de lente única o lente intercambiable sin espejo con una lente macro compatible. La captura de objetos muy pequeños puede requerir una combinación de una cámara y un microscopio; sin embargo, una lente macro generalmente tiene suficiente aumento (al menos 1: 2) para obtener imágenes detalladas de un corazón de ratón. Muchos fabricantes ofrecen cámaras digitales asequibles y lentes macro para obtener fotografías de alta resolución y gran aumento. Todas las cámaras digitales actualizadas tienen características y funciones necesarias para la fotografía macro, incluida la posibilidad de montar en un soporte, un alto número de píxeles (generalmente >20 Mpx), vista en vivo, bloqueo de espejo, funciones de lapso de tiempo, obturador remoto y la capacidad de configurar manualmente los parámetros de la cámara, lo que garantiza una velocidad de obturación constante, apertura, balance de blancos y ajuste ISO. Las cámaras compactas con las características mencionadas anteriormente y un aumento de lente de al menos 1: 2 también se pueden usar para fotografía macro. Debido a las características de la lente, algunas cámaras compactas deben colocarse muy cerca del objeto, y el experimentador debe asegurarse de que el cuerpo de la cámara no afecte la iluminación de la muestra.

Para la fotografía macro con cualquier tipo de cámara de lente intercambiable, se requiere una lente macro de alto aumento (1: 1-1: 2). Sugerimos utilizar lentes macro con una distancia focal que oscila entre 50 mm y 100 (120) mm o equivalente en el sensor de fotograma completo (24 mm x 36 mm). Las cámaras de sensor más pequeñas tienen diferentes tamaños de sensor, y la ampliación debe recalcularse en consecuencia. Para la fotografía de cortes de corazón, una distancia ergonómica del elemento frontal de la lente macro de 100 mm al sujeto es de aproximadamente 150 mm. Esta configuración permite a los operadores mantener todo el equipo sobre una mesa, con fácil acceso a los controles de la cámara. Se podría considerar un objetivo macro de 50 mm para la fotografía de objetos más grandes, como cortes de cerebro, porque se necesita un campo de visión más amplio para obtener todos los cortes en una sola fotografía.

Para obtener imágenes nítidas con alta resolución, una cámara debe montarse en un soporte resistente, que, junto con una configuración de luz, se denomina soporte de copia de fotografía. Montar la cámara en un soporte y un disparador remoto (con cable o inalámbrico) elimina el movimiento de la cámara y garantiza una distancia constante del objetivo. Una configuración de iluminación de cámara con dos fuentes de luz constante desde ambos lados, en ángulo de aproximadamente 30-60 ° en relación con el plano del sujeto, garantiza una iluminación suficiente de las muestras y ayuda a evitar reflejos al mismo tiempo. La cámara debe montarse con precisión para que el sensor esté paralelo al plano del sujeto. Para iluminar uniformemente el campo de la imagen, ambas lámparas deben estar igualmente orientadas y colocadas a la misma distancia del sujeto. Las fuentes de luz colocadas a varias distancias del sujeto causan una iluminación desigual. Además, las fuentes de luz parpadeantes son una razón para las variaciones en la exposición de la imagen. En general, es importante colocar con precisión la cámara y las fuentes de luz para adquirir con precisión imágenes de especímenes bien iluminados.

Las muestras de tejido reflejan la luz (brillo), que aparecen como manchas blancas en las imágenes. Estos puntos de reflexión de la luz no contienen información de color útil y, en consecuencia, estas partes de las imágenes no se pueden utilizar para un análisis cuantitativo preciso de las imágenes. Los reflejos de luz de las rodajas de tejido se pueden eliminar por varios métodos. La más eficiente es la inmersión completa de muestras de tejido en un recipiente con una solución salina o PBS. Un enfoque similar es la inserción de rodajas de tejido debajo (o entre) placas de vidrio. Este método es eficiente contra las reflexiones; sin embargo, la resolución de la imagen puede ser inferior a la de las fotografías de tejidos sumergidos.

También se puede usar un filtro polarizador montado en una lente para eliminar los reflejos de la luz. Los filtros polarizadores circulares están ampliamente disponibles, pero varían considerablemente en calidad dependiendo del precio, y los filtros baratos pueden reducir significativamente la resolución de la imagen. La luz reflejada se puede filtrar girando la parte móvil del filtro polarizador en ángulo. La eficacia del filtro polarizador puede verse afectada por algunas fuentes de luz (por ejemplo, luz LED fuerte). En general, después de la eliminación del líquido adicional, un filtro polarizador puede eliminar todos los reflejos de las rodajas cerebrales; sin embargo, la inmersión de la muestra en la solución tampón es el enfoque más fácil y rentable para los cortes de corazón.

La configuración manual de la velocidad de obturación, la apertura, el ISO y el balance de blancos son importantes para mantener el control total del proceso de obtención de imágenes. La muestra, el fondo y las características de la fuente de luz influyen en el sistema de medición de la exposición de la cámara en la configuración automática; por lo tanto, los ajustes manuales son necesarios para mantener la exposición constante y el balance de blancos entre múltiples fotografías durante el experimento. Para la fotografía macro, el ajuste de apertura sugerido está entre f/8 y f/16. Al disminuir la apertura, la profundidad de campo aumenta, lo cual es útil si el objeto no está en un solo plano. Sin embargo, la difracción limita la resolución total de la fotografía en el caso de aperturas más pequeñas. La apertura óptima para la mayoría de las lentes suele ser f / 10 porque en esta configuración, la caída de resolución es insignificante y la profundidad de campo es suficiente. Los valores ISO que oscilan entre 50 y 400 (más bajo es mejor) suelen ser óptimos para minimizar los artefactos de imagen (ruido). La velocidad de obturación queda por cambiar para obtener una exposición correcta utilizando la apertura mencionada y la configuración ISO en las condiciones de luz existentes. La configuración manual es importante para un análisis de imagen coherente. Las imágenes estandarizadas aseguran el uso de la misma configuración de umbral de color en cualquier estudio, lo que requiere un análisis de segmentación. Por ejemplo, el análisis semiautomatizado por el software ImagePro basado en un archivo de segmentación con colores predefinidos de azul, rojo y blanco (+ rosa pálido) se puede utilizar a lo largo de los años si las imágenes de muestra tienen colores consistentes, balance de blancos y exposición.

El ajuste del balance de blancos debe ajustarse en función de la temperatura de color de la fuente de luz que se utiliza para iluminar una muestra. El balance de blancos se puede seleccionar a partir de los ajustes preestablecidos integrados de la cámara o mediante la calibración manual de un objetivo gris. El beneficio de la captura de imágenes en formato RAW es que el balance de blancos se puede ajustar durante el postprocesamiento de la imagen por software. Como los archivos RAW contienen mucha más información que los archivos JPEG, el posprocesamiento de archivos RAW ofrece una excelente oportunidad para la corrección del equilibrio de color y la exposición, así como para obtener una mejor resolución de imagen. Debido a que la mayoría de las cámaras pueden capturar archivos JPEG y RAW simultáneamente, sugerimos capturar el archivo RAW y guardarlo como copia de seguridad.

En general, este protocolo describe una metodología para el corte y tinción de corazón de rata y tejido cerebral y proporciona pautas para establecer configuraciones de iluminación y cámara y técnicas de fotografía para la adquisición de imágenes de alta resolución para su posterior análisis. Este método es aplicable a todas las fotografías experimentales de órganos de animales pequeños.