Подготовка сердца и мозговой ткани грызунов к цифровой макрофотографии после ишемии-реперфузии

Подготовка сердца после ИК начинается с повторного прикуса сердечных артерий крови и перфузии синего красителя для дискриминации зон риска из зон, не относящихся к риску. Для этой цели чаще всего используются красители метиленовый синий или синий ^{Эванса2}. Поскольку чрезмерно высокое давление может повредить сердечные клапаны и, таким образом, частично или полностью испачкать области риска, лучше перфузировать сердце с помощью системы с контролируемым давлением, такой как аппарат Лангендорфа или упрощенная версия шприца или насоса, оснащенного гидростатической системой давления. Контролируемая перфузия обеспечит физиологическое давление, и краситель обычно не попадает в закупоренную область сердца. Методы, контролируемые как скоростью потока, так и методы, контролируемые давлением, являются защитой от чрезмерного загрязнения.

Одной из самых серьезных ошибок в жизнеспособной обработке тканей является хранение тканей в морозильной камере в течение длительного времени перед окрашиванием. Замораживание в основном используется, потому что исследователи хотят выполнить окрашивание сердца на следующий день после ИК-эксперимента или позже. Кроме того, замораживание используется для облегчения разрезания сердца. Мы обнаружили, что кратковременное замораживание сердца на срок до 5-10 мин незначительно влияет на целостность тканей сердца и облегчает разрезание тканей (особенно для мышечных сердец) на тонкие срезы. Однако замораживание в течение длительных периодов времени повреждает мембраны и снижает жизнеспособность клеток и функцию митохондрий13. В результате поражается окрашивание ТТС функционирующих митохондрий, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями плохо очерчена (размыта). В целом, следует избегать замораживания крысиных хартов, и только кратковременное замораживание мышечных сердец может быть использовано для более легкой резки.

Следующим этапом является окрашивание тканей в 1% раствор TTC при 37 °^C14. Окрашивающий раствор должен быть предварительно расплавленным, что особенно важно для окрашивания срезов мозга. При использовании предварительного раствора оптимальное время окрашивания сердечных ломтиков составляет 10 мин. Более длительная инкубация или температура выше 37 °C приводит к коричневой окраске тканей сердца. Правильное окрашивание образцов и постоянная интенсивность красного цвета важны для дальнейшего анализа изображения. На заключительных этапах перед фотографированием срезы ткани промывают 2-3 раза холодным PBS или аналогичным буфером для удаления TTC и избытка метиленового синего из раствора, чтобы избежать синего отливки на фотографии. Сердечные срезы должны быть сфотографированы вскоре после окрашивания, чтобы получить наилучшее качество изображения. Окрашивание сердца остается хорошего качества при хранении до 60 мин в холоде (+4 °C) PBS. Окрашенные срезы мозга и ткани аорты обычно хранятся в 4% нейтральном растворе формальдегида и сохраняют хорошее качество в течение недели. Ночное хранение тканей головного мозга в формалине (+4 °C) не ухудшает интенсивность цвета нормальной ткани и приемлемо для получения изображения. Однако формалин вызывает отек и расчесывание сердечных ломтиков. Поэтому хранение тканей сердца в формалине не рекомендуется.

Следующим шагом является получение изображения. Многие лаборатории используют планшетные сканеры в качестве инструмента сбора изображений, который, как ожидается, заменит цифровую камеру и установку освещения. Мы определили, что сканирование срезов не обеспечивает достаточного разрешения изображения и цветоделия и, следовательно, не подходит для визуализации сердечных срезов. В частности, разрешение сканера недостаточно для мышечных сердец, и мы заметили плохую визуализацию метиленового синего. Напротив, сканер может быть альтернативой фотокамере для визуализации срезов мозга, окрашенных только TTC или другими одиночными красителями. Для сканирования срезов тканей важное значение имеет программное обеспечение для сканирования, которое обеспечивает постоянные настройки экспозиции. В целом, планшетный сканер менее эффективен и не может заменить цифровую камеру для большинства приложений для обработки изображений.

Фон за образцами также важен. В идеале дно лотка должно быть цвета, отсутствующего в окрашенном образце. Например, для количественной оценки площади окрашивания метиленовым синим и TTC (красным) автоматическим или полуавтоматизированным способом следует избегать белого, красного, синего, желтого и коричневого фонов. Таким образом, зеленый фон был бы предпочтительнее. Тем не менее, выбор цвета зависит от предпочтений оператора, который постобрабатывает изображение. Многие ученые предпочитают белый фон, потому что белый фон может быть удален при постобработке изображения и преобразован в полностью белый (белый код RGB 255,255,255). Затем следует исключить полностью белый из списка выбранных цветов, используемых для полуавтоматизированного анализа, и считать только бледные некротические участки, которые не являются полностью белыми, если не переэкспонированы. Синий и зеленый фоны подходят для фотографирования срезов мозга и аорты.

Оптимальным инструментом визуализации для тканевой фотографии является однообъективная рефлекторная или беззеркальная цифровая камера со сменным объективом с совместимым макрообъективом. Для захвата очень маленьких объектов может потребоваться сочетание камеры и микроскопа; тем не менее, макрообъектив обычно имеет достаточное (по крайней мере, 1:2) увеличение для получения подробных изображений сердца мыши. Многие производители предлагают доступные цифровые камеры и макрообъективы для получения фотографий с высоким разрешением и высоким увеличением. Все современные цифровые камеры имеют характеристики и функции, необходимые для макросъемки, включая возможность крепления на подставке, большое количество пикселей (обычно >20 Mpx), просмотр в реальном времени, блокировку зеркала, функции покадровой съемки, дистанционный затвор и возможность вручную устанавливать параметры камеры, обеспечивая тем самым постоянную выдержку, диафрагму, баланс белого и настройку ISO. Компактные камеры с вышеупомянутыми функциями и увеличением объектива не менее 1:2 также могут использоваться для макросъемки. Из-за характеристик объектива некоторые компактные камеры следует размещать в непосредственной близости от объекта, а экспериментатор должен следить за тем, чтобы корпус камеры не влиял на освещенность образца.

Для макросъемки с любым типом камеры со сменным объективом требуется макрообъектив с большим увеличением (1:1-1:2). Мы предлагаем использовать макрообъективы с фокусным расстоянием от 50 мм до 100 (120) мм или эквивалент на полнокадровом (24 мм x 36 мм) сенсоре. Меньшие сенсорные камеры имеют разные размеры датчиков, и увеличение должно быть пересчитано соответствующим образом. Для фотосъемки срезов сердца эргономичное расстояние переднего элемента макрообъектива 100 мм до объекта съемки составляет примерно 150 мм. Эта настройка позволяет операторам держать все оборудование на столе с легким доступом к элементам управления камерой. Макрообъектив диаметром 50 мм может быть рассмотрен для фотографирования более крупных объектов, таких как срезы мозга, поскольку для получения всех срезов на одной фотографии необходимо более широкое поле зрения.

Для получения четких изображений с высоким разрешением камера должна быть установлена на прочной подставке, которая вместе со световой установкой называется подставкой для копирования фотографий. Установка камеры на подставку и дистанционный (проводной или беспроводной) триггер исключает дрожание камеры и обеспечивает постоянное расстояние от цели. Система освещения камеры с двумя постоянными источниками света с обеих сторон, расположенными под углом примерно 30-60° относительно плоскости объекта, обеспечивает достаточную освещенность образцов и помогает избежать отражений одновременно. Камера должна быть установлена точно так, чтобы датчик был параллельен плоскости объекта. Чтобы равномерно осветить поле изображения, обе лампы должны быть одинаково ориентированы и размещены на одинаковом расстоянии от объекта. Источники света, размещенные на различных расстояниях от объекта, вызывают неравномерное освещение. Кроме того, мигающие источники света являются причиной различий в экспозиции изображения. В целом, важно точно разместить камеру и источники света, чтобы точно получать изображения хорошо освещенных образцов.

Образцы тканей отражают свет (блеск), который выглядит как белые пятна на изображениях. Эти светоотражающие пятна не содержат полезной цветовой информации, и соответственно, эти части изображений не могут быть использованы для точного количественного анализа изображений. Отражения света от срезов ткани могут быть удалены различными методами. Наиболее эффективным является полное погружение образцов тканей в контейнер с физиологическим раствором или раствором PBS. Аналогичным подходом является введение срезов ткани ниже (или между) стеклянными пластинами. Этот метод эффективен против отражений; однако разрешение изображения может быть ниже, чем у фотографий погруженных тканей.

Можно также использовать поляризационный фильтр, установленный на объективе, чтобы устранить отражения света. Циркулярные поляризационные фильтры широко доступны, но значительно различаются по качеству в зависимости от цены, а дешевые фильтры могут значительно снизить разрешение изображения. Отраженный свет можно отфильтровать, повернув движущуюся часть поляризационного фильтра под углом. На эффективность поляризационного фильтра могут влиять некоторые источники света (например, сильный светодиодный свет). В целом, после удаления лишней жидкости поляризационный фильтр может устранить все отражения от срезов мозга; однако погружение образца в буферный раствор является самым простым и экономически эффективным подходом для сердечных срезов.

Ручные настройки выдержки, диафрагмы, ISO и баланса белого важны для поддержания полного контроля над процессом обработки изображений. Образец, фон и характеристики источника света влияют на систему измерения экспозиции камеры в автоматических настройках; поэтому ручные настройки необходимы для поддержания постоянной экспозиции и баланса белого между несколькими фотографиями во время эксперимента. Для макросъемки рекомендуемая настройка диафрагмы находится между f/8 и f/16. Уменьшая диафрагму, увеличивается глубина резкости, что полезно, если объект не находится в одной плоскости. Однако дифракция ограничивает общее разрешение фотографии в случае меньших диафрагм. Оптимальная диафрагма для большинства объективов обычно составляет f/ 10, потому что в этом случае падение разрешения незначительно, а глубина резкости достаточна. Значения ISO, которые варьируются от 50 до 400 (чем ниже, тем лучше), обычно оптимальны для минимизации артефактов изображения (шума). Затем выдержка остается изменить для получения правильной экспозиции с использованием упомянутых настроек диафрагмы и ISO в существующих условиях освещения. Ручные настройки важны для согласованного анализа изображений. Стандартизированная визуализация обеспечивает использование одних и тех же настроек цветового порога во всем исследовании, что требует сегментационного анализа. Например, полуавтоматизированный анализ программным обеспечением ImagePro на основе файла сегментации с предопределенными цветами синего, красного и белого (+бледно-розовый) может использоваться в течение многих лет, если изображения образцов имеют согласованные цвета, баланс белого и экспозицию.

Настройка баланса белого должна быть отрегулирована в зависимости от цветовой температуры источника света, который используется для освещения образца. Баланс белого можно выбрать из встроенных предустановок камеры или с помощью ручной калибровки серой мишени. Преимущество захвата изображения в формате RAW заключается в том, что баланс белого можно настроить во время программной постобработки изображения. Поскольку файлы RAW содержат гораздо больше информации, чем файлы JPEG, постобработка файлов RAW предоставляет отличную возможность для коррекции цветового баланса и экспозиции, а также для получения лучшего разрешения изображения. Поскольку большинство камер могут захватывать файлы JPEG и RAW одновременно, мы рекомендуем захватить файл RAW и сохранить его в качестве резервной копии.

В целом, этот протокол описывает методологию нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга крыс и предоставляет рекомендации по созданию освещения и настроек камер и методов фотографии для получения изображений с высоким разрешением для дальнейшего анализа. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.