虚血再灌流後のデジタルマクロ写真のためのげっ歯類の心臓および脳組織の準備

IR後の心臓の準備は、血液心臓動脈の再閉塞および非リスク領域からのリスク領域の識別のための青色色素の灌流から始まる。メチレンブルーまたはエバンスブルー染料は、この目的のために最も頻繁に使用されます²。過度に高い圧力は心臓弁を損傷し、したがって、リスクのある領域を部分的または完全に染色する可能性があるため、ランゲンドルフ装置または静水圧システム搭載シリンジまたはポンプの簡略化されたバージョンなどの圧力制御システムで心臓を灌流する方がよい。制御された灌流は生理学的圧力を確保し、色素は通常心臓の閉塞領域に入らない。流速制御技術と圧力制御技術の両方が、オーバーステインに対する保護手段です。

生存可能な組織処理における最も重大な間違いの1つは、染色前に組織を長期間冷凍庫に保管することです。凍結は、研究者がIR実験の翌日以降に心臓染色を行いたいため、主に使用されています。さらに、凍結は心臓の切断を容易にするために使用されます。我々は、心臓を5〜10分間まで短期間凍結することは、心臓組織の完全性に無視できるほど影響し、組織(特にマウス心臓の場合)を薄いスライスに切断することを容易にすることを見出した。しかし、長期間凍結すると膜が損傷し、細胞の生存率とミトコンドリア機能が低下します¹³。その結果、機能しているミトコンドリアのTTC染色が冒され、壊死組織と生存組織の境界がほとんど線引きされない(ぼやけている)。全体として、ラットハートの凍結は避けるべきであり、マウスの心臓の短期的な凍結のみがより簡単な切断のために使用することができる。

次のステップは、37°Cの1%TTC溶液中での組織染色^である14。染色液は、脳スライスの染色に特に重要である、予め温めておくべきである。予温した溶液を使用する場合、心臓スライスの最適な染色時間は10分です。より長いインキュベーションまたは37°Cより高い温度は、心臓組織の茶色の着色をもたらす。標本の適切な染色と一貫した赤色の強度は、さらなる画像解析にとって重要です。写真撮影前の最終ステップでは、組織スライスを冷たいPBSまたは同様の緩衝液で2〜3回すすぎ、溶液からTTCおよび過剰なメチレンブルーを除去し、写真の青色キャストを回避する。心臓のスライスは、最高の画質を得るために染色直後に撮影する必要があります。心臓染色は、低温(+4°C)PBS中で最大60分間保存した場合、良質のままである。染色された脳スライスおよび大動脈組織は、通常、4%中性ホルムアルデヒド溶液に保存され、1週間良好な品質を保持する。ホルマリン(+4°C)での脳組織の一晩保存は、正常組織の発色強度を損なわず、画像取得に許容される。しかし、ホルマリンは心臓スライスの腫脹および脱染を誘発する。したがって、ホルマリン中の心臓組織の保存は推奨されない。

次のステップは画像取得です。多くの研究室では、デジタルカメラや照明設定に代わる画像取得ツールとしてフラットベッドスキャナを使用しています。スライスのスキャンは十分な画像解像度と色分解を提供しないため、心臓スライスのイメージングには適していないと判断しました。特に、スキャナの解像度はマウスの心臓には不十分であり、メチレンブルーのレンダリングが悪いことに気付きました。対照的に、スキャナは、TTCまたは他の単一の染料のみで染色された脳スライスを撮像するためのフォトカメラの代替物であり得る。組織スライスのスキャンには、一定の露出設定を保証するスキャンソフトウェアが不可欠です。全体として、フラットベッドスキャナは能力が低く、ほとんどのイメージングアプリケーションでデジタルカメラを置き換えることはできません。

標本の背景も重要です。理想的には、トレイの底部は染色された標本に存在しない色であるべきです。例えば、メチレンブルーおよびTTC(赤)染色の面積を自動または半自動の方法で定量化するために、白、赤、青、黄、および茶色の背景は避けるべきである。したがって、緑色の背景が好ましいでしょう。それにもかかわらず、色の選択は、画像を後処理するオペレータの好みに依存する。多くの科学者は、白い背景を画像の後処理で削除して完全に白に変換できるため、白い背景を好みます(RGB白色コード255,255,255)。次に、半自動分析に使用される選択した色のリストから完全に白を除外し、露出過多でなければ完全に白くない淡い壊死領域のみをカウントする必要があります。青と緑の背景は、脳のスライスや大動脈の写真撮影に適しています。

組織写真に最適な撮像ツールは、互換性のあるマクロレンズを備えた一眼レフまたはミラーレスレンズ交換式デジタルカメラです。非常に小さなオブジェクトをキャプチャするには、カメラと顕微鏡の組み合わせが必要になる場合があります。それにもかかわらず、マクロレンズは、通常、マウス心臓の詳細な画像を得るのに十分な(少なくとも1:2の)倍率を有する。多くのメーカーは、高解像度と高倍率の写真を得るために手頃な価格のデジタルカメラとマクロレンズを提供しています。すべての最新のデジタルカメラは、スタンドにマウントする可能性、ピクセル数が多い(通常>20 Mpx)、ライブビュー、ミラーロックアップ、タイムラプス機能、リモートシャッター、カメラパラメータを手動で設定する機能など、マクロ撮影に必要な特性と機能を備えており、一定のシャッタースピード、絞り、ホワイトバランス、ISO設定を保証します。上記の機能とレンズ倍率が少なくとも1:2のコンパクトカメラは、マクロ撮影にも使用できます。レンズの特性のため、一部のコンパクトカメラは物体のすぐ近くに配置する必要がありますが、実験者はカメラ本体が試料の照明に影響を与えないようにする必要があります。

レンズ交換式カメラでのマクロ撮影には、高倍率(1:1-1:2)のマクロレンズが必要です。フルフレーム(24 mm x 36 mm)センサーでは、焦点距離が50 mm~100 mmまたは同等のマクロレンズを使用することをお勧めします。小型のセンサーカメラではセンサーサイズが異なるため、それに応じて倍率を再計算する必要があります。心臓のスライスを撮影する場合、100mmのマクロレンズフロントエレメントから被写体までの人間工学に基づいた距離は約150mmです。この設定により、オペレータはすべての機器をテーブル上に保持し、カメラコントロールに簡単にアクセスできます。1枚の写真ですべてのスライスを取得するには、より広い視野が必要であるため、脳スライスなどの大きな物体の写真撮影には50mmのマクロレンズが考慮されるかもしれません。

高解像度で鮮明な画像を得るには、カメラを頑丈なスタンドに取り付ける必要があります。カメラをスタンドとリモート(有線またはワイヤレス)トリガーに取り付けると、手ぶれがなくなり、ターゲットから一定の距離が確保されます。被写体平面に対して約30〜60°の角度で、両側からの2つの一定の光源を備えたカメラ照明設定は、試料の十分な照明を確保し、同時に反射を避けるのに役立ちます。カメラは、センサーが被写体平面に平行になるように正確に取り付ける必要があります。画像フィールドを均等に照らすには、両方のランプを均等に向き、被写体から同じ距離に配置する必要があります。被写体からさまざまな距離に置かれた光源は、不均一な照明を引き起こします。さらに、点滅する光源は、画像露光の変動の理由である。全体として、カメラと光源を正確に配置して、十分に照らされた標本の画像を正確に取得することが重要です。

組織サンプルは光を反射し(キラキラ)、画像内に白い斑点として現れる。これらの光反射スポットには有用な色情報が含まれていないため、画像のこれらの部分は画像の正確な定量分析には使用できません。組織スライスからの光反射は、様々な方法によって除去することができる。最も効率的なのは、生理食塩水またはPBS溶液を含む容器に組織サンプルを完全に浸漬することです。同様のアプローチは、ガラス板の下(または間)の組織スライスの挿入である。この方法は、反射に対して効率的です。ただし、画像解像度は浸漬組織の写真の解像度よりも低くなる可能性があります。

レンズに取り付けられた偏光フィルターを使用して、光の反射を排除することもできます。円偏光フィルターは広く入手可能ですが、価格によって品質がかなり異なり、安価なフィルターは画像の解像度を大幅に低下させる可能性があります。反射光は、偏光フィルタの可動部を斜めに回すことでフィルタリングすることができる。偏光フィルタの有効性は、いくつかの光源(例えば、強いLED光)によって影響を受ける可能性がある。全体として、余分な液体を除去した後、偏光フィルターは脳スライスからのすべての反射を除去することができる。しかし、バッファー溶液へのサンプル浸漬は、心臓スライスにとって最も簡単でコスト効率の高いアプローチです。

シャッタースピード、絞り、ISO、ホワイトバランスの手動設定は、イメージングプロセスを完全に制御するために重要です。光源のサンプル、背景、および特性は、自動設定のカメラ露出測光システムに影響を与えます。したがって、実験中に複数の写真間で一定の露出とホワイトバランスを維持するためには、手動設定が必要です。マクロ写真の場合、推奨される絞り設定は f/8 ~ f/16 です。絞りを小さくすると被写界深度が増加します。これは、オブジェクトが単一の平面内にない場合に役立ちます。しかし、回折は、より小さな絞りの場合、写真の総解像度を制限します。ほとんどのレンズの最適な絞りは、通常 f/10 です。これは、この設定では解像度の低下が無視でき、被写界深度で十分であるためです。通常、50 ~ 400 の範囲の ISO 値は、画像のアーチファクト (ノイズ) を最小限に抑えるのに最適です。シャッタースピードは、既存の光条件で前述の絞りとISOの設定を使用して正しい露出を得るために変更する必要があります。手動設定は、一貫した画像解析のために重要です。標準化されたイメージングにより、セグメンテーション分析を必要とするあらゆる研究全体で同じ色のしきい値設定を使用できます。たとえば、青、赤、白(+淡いピンク)の定義済みの色を持つセグメンテーションファイルに基づくImageProソフトウェアによる半自動分析は、試料画像に一貫した色、ホワイトバランス、露出がある場合、長年にわたって使用できます。

ホワイトバランス設定は、サンプルを照らすために使用される光源の色温度に応じて調整する必要があります。ホワイトバランスは、カメラ内蔵プリセットから選択することも、グレーターゲットの手動キャリブレーションを使用して選択することもできます。RAW形式での画像キャプチャの利点は、画像のソフトウェア後処理中にホワイトバランスを調整できることです。RAWファイルにはJPEGファイルよりもはるかに多くの情報が含まれているため、RAWファイルの後処理は、カラーバランスと露出の補正だけでなく、より良い画像解像度を得るための優れた機会を提供します。ほとんどのカメラは JPEG ファイルと RAW ファイルを同時にキャプチャできるため、RAW ファイルをキャプチャしてバックアップとして保存することをお勧めします。

全体として、このプロトコルは、ラットの心臓および脳組織のスライスおよび染色のための方法論を説明し、さらなる分析のための高解像度画像取得のための照明およびカメラセットアップおよび写真技術を確立するためのガイドラインを提供する。この方法は、すべての実験的小動物臓器写真に適用可能である。