Preparazione del cuore e del tessuto cerebrale dei roditori per la fotografia macro digitale dopo ischemia-riperfusione

La preparazione del cuore dopo IR inizia con la riacclusione delle arterie cardiache del sangue e la perfusione di colorante blu per la discriminazione delle aree a rischio dalle aree non a rischio. I coloranti blu di metilene o blu evans sono più frequentemente utilizzati per questo ^scopo2. Poiché una pressione eccessivamente elevata potrebbe danneggiare le valvole cardiache e, quindi, macchiare parzialmente o completamente le aree a rischio, è meglio perfondere il cuore con un sistema controllato dalla pressione, come l’apparecchio Langendorff o una versione semplificata di una siringa o pompa dotata di un sistema di pressione idrostatica. La perfusione controllata garantirà una pressione fisiologica e il colorante di solito non entrerà nella regione occlusa del cuore. Entrambe le tecniche di controllo della velocità del flusso e della pressione sono salvaguardie contro l’eccessiva colorazione.

Uno degli errori più gravi nella lavorazione dei tessuti vitali è tenere i tessuti in un congelatore per un tempo prolungato prima della colorazione. Il congelamento viene utilizzato principalmente perché i ricercatori vogliono eseguire la colorazione del cuore il giorno dopo l’esperimento IR o più tardi. Inoltre, il congelamento viene utilizzato per facilitare il taglio del cuore. Abbiamo scoperto che il congelamento a breve termine del cuore per un massimo di 5-10 minuti influisce in modo trascurabile sull’integrità dei tessuti cardiaci e facilita il taglio dei tessuti (in particolare per i cuori di topo) in fette sottili. Tuttavia, il congelamento per periodi prolungati danneggia le membrane e diminuisce la vitalità cellulare e la funzione mitocondriale13. Di conseguenza, la colorazione TTC dei mitocondri funzionanti è influenzata e il confine tra tessuti necrotici e vitali è scarsamente delineato (sfocato). Nel complesso, il congelamento degli hart di ratto dovrebbe essere evitato e solo il congelamento a breve termine dei cuori di topo può essere utilizzato per un taglio più facile.

Il passo successivo è la colorazione dei tessuti in soluzione di TTC all’1% a 37 °^C14. La soluzione di colorazione dovrebbe essere prebellica, particolarmente importante per la colorazione delle fette di cervello. Quando si utilizza la soluzione preriscaldata, il tempo di colorazione ottimale per le fette di cuore è di 10 minuti. Un’incubazione più lunga o una temperatura superiore a 37 °C provoca la colorazione marrone dei tessuti cardiaci. Una corretta colorazione dei campioni e un’intensità costante del colore rosso sono importanti per ulteriori analisi delle immagini. Nelle fasi finali prima della fotografia, le fette di tessuto vengono risciacquate 2-3 volte con PBS freddo o un tampone simile per rimuovere TTC e blu di metilene in eccesso dalla soluzione per evitare la fusione blu nella fotografia. Le fette di cuore dovrebbero essere fotografate poco dopo la colorazione per ottenere la migliore qualità dell’immagine. La colorazione cardiaca rimane di buona qualità se conservata fino a 60 minuti nel PBS freddo (+4 °C). Le fette di cervello colorate e i tessuti aortici vengono solitamente conservati in una soluzione di formaldeide neutra al 4% e mantengono una buona qualità per una settimana. La conservazione notturna dei tessuti cerebrali in formalina (+4 °C) non compromette l’intensità del colore del tessuto normale ed è accettabile per l’acquisizione dell’immagine. Tuttavia, la formalina induce gonfiore e destaining delle fette di cuore. Pertanto, la conservazione dei tessuti cardiaci nella formalina non è raccomandata.

Il prossimo passo è l’acquisizione di immagini. Molti laboratori utilizzano scanner piani come strumento di acquisizione delle immagini che dovrebbe sostituire una fotocamera digitale e una configurazione dell’illuminazione. Abbiamo stabilito che la scansione delle fette non fornisce una risoluzione dell’immagine e una separazione dei colori sufficienti e quindi non è adatta per l’imaging di fette di cuore. In particolare, la risoluzione dello scanner è insufficiente per i cuori dei mouse e abbiamo notato una scarsa resa del blu di metilene. Al contrario, uno scanner potrebbe essere un’alternativa a una fotocamera per l’imaging di fette di cervello macchiate solo con TTC o altri coloranti singoli. Per la scansione di fette di tessuto, è essenziale un software di scansione che garantisca impostazioni di esposizione costanti. Nel complesso, uno scanner piano è meno capace e non può sostituire una fotocamera digitale per la maggior parte delle applicazioni di imaging.

Anche lo sfondo dietro gli esemplari è importante. Idealmente, il fondo del vassoio dovrebbe essere di un colore non presente nel campione macchiato. Ad esempio, per quantificare l’area della colorazione blu di metilene e TTC (rosso) in modo automatizzato o semiautomatico, è necessario evitare sfondi bianchi, rossi, blu, gialli e marroni. Pertanto, uno sfondo verde sarebbe preferibile. Tuttavia, la selezione del colore dipende dalle preferenze dell’operatore, che post-elabora l’immagine. Molti scienziati preferiscono uno sfondo bianco perché uno sfondo bianco può essere eliminato nella post-elaborazione delle immagini e convertito in completamente bianco (codice bianco RGB 255.255.255). Quindi, si dovrebbe escludere completamente il bianco dall’elenco dei colori selezionati utilizzati per l’analisi semiautomatica e contare solo le aree necrotiche pallide, che non sono completamente bianche se non sovraesposte. Gli sfondi blu e verdi sono adatti per la fotografia di fette di cervello e aorte.

Lo strumento di imaging ottimale per la fotografia tissutale è una fotocamera digitale reflex o mirrorless con obiettivo intercambiabile a obiettivo singolo con un obiettivo macro compatibile. La cattura di oggetti molto piccoli potrebbe richiedere una combinazione di una fotocamera e un microscopio; tuttavia, un obiettivo macro di solito ha un ingrandimento sufficiente (almeno 1:2) per ottenere immagini dettagliate di un cuore di topo. Molti produttori offrono fotocamere digitali e obiettivi macro a prezzi accessibili per ottenere fotografie ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento. Tutte le fotocamere digitali aggiornate hanno caratteristiche e funzioni necessarie per la fotografia macro, tra cui la possibilità di montare su un supporto, un numero elevato di pixel (di solito >20 Mpx), live view, mirror lock-up, funzioni time-lapse, otturatore remoto e la possibilità di impostare manualmente i parametri della fotocamera, garantendo così una velocità dell’otturatore costante, apertura, bilanciamento del bianco e impostazione ISO. Le fotocamere compatte con le caratteristiche sopra menzionate e l’ingrandimento dell’obiettivo di almeno 1: 2 possono essere utilizzate anche per la fotografia macro. A causa delle caratteristiche dell’obiettivo, alcune fotocamere compatte devono essere posizionate in prossimità dell’oggetto e lo sperimentatore deve assicurarsi che il corpo della fotocamera non influisca sull’illuminazione del campione.

Per la fotografia macro con qualsiasi tipo di fotocamera con obiettivo intercambiabile, è necessario un obiettivo macro ad alto ingrandimento (1:1-1:2). Suggeriamo di utilizzare obiettivi macro con una lunghezza focale compresa tra 50 mm e 100 (120) mm o equivalente sul sensore full-frame (24 mm x 36 mm). Le fotocamere con sensore più piccolo hanno dimensioni del sensore diverse e l’ingrandimento deve essere ricalcolato di conseguenza. Per la fotografia di fette di cuore, una distanza ergonomica dell’elemento frontale dell’obiettivo macro da 100 mm al soggetto è di circa 150 mm. Questa impostazione consente agli operatori di tenere tutte le apparecchiature su un tavolo, con un facile accesso ai comandi della telecamera. Un obiettivo macro da 50 mm potrebbe essere preso in considerazione per la fotografia di oggetti più grandi, come le fette di cervello, perché è necessario un campo visivo più ampio per ottenere tutte le fette in una singola fotografia.

Per ottenere immagini nitide ad alta risoluzione, una fotocamera deve essere montata su un supporto robusto, che, insieme a una configurazione leggera, è chiamato supporto per fotocopie fotografiche. Il montaggio della telecamera su un supporto e un trigger remoto (cablato o wireless) elimina le vibrazioni della fotocamera e garantisce una distanza costante dal bersaglio. Una configurazione di illuminazione della telecamera con due sorgenti luminose costanti da entrambi i lati, angolate di circa 30-60 ° rispetto al piano del soggetto, garantisce un’illuminazione sufficiente dei campioni e aiuta a evitare i riflessi allo stesso tempo. La fotocamera deve essere montata con precisione in modo che il sensore sia parallelo al piano del soggetto. Per illuminare uniformemente il campo dell’immagine, entrambe le lampade devono essere ugualmente orientate e posizionate alla stessa distanza dal soggetto. Le sorgenti luminose poste a varie distanze dal soggetto causano un’illuminazione irregolare. Inoltre, le sorgenti luminose lampeggianti sono un motivo per le variazioni nell’esposizione dell’immagine. Nel complesso, è importante posizionare con precisione la fotocamera e le fonti di luce per acquisire con precisione immagini di campioni ben illuminati.

I campioni di tessuto riflettono la luce (glisten), che appare come macchie bianche nelle immagini. Questi punti di riflessione della luce non contengono informazioni utili sul colore e, di conseguenza, queste parti delle immagini non possono essere utilizzate per un’analisi quantitativa accurata delle immagini. I riflessi di luce dalle fette di tessuto possono essere rimossi con vari metodi. Il più efficiente è la full immersion di campioni di tessuto in un contenitore con una soluzione salina o PBS. Un approccio simile è l’inserimento di fette di tessuto sotto (o tra) lastre di vetro. Questo metodo è efficace contro le riflessioni; tuttavia, la risoluzione dell’immagine può essere inferiore a quella delle fotografie di tessuti immersi.

Si può anche usare un filtro polarizzatore montato su una lente per eliminare i riflessi di luce. I filtri polarizzanti circolari sono ampiamente disponibili, ma variano considerevolmente in termini di qualità a seconda del prezzo e i filtri economici possono ridurre significativamente la risoluzione dell’immagine. La luce riflessa può essere filtrata ruotando la parte mobile del filtro polarizzatore ad angolo. L’efficacia del filtro polarizzatore potrebbe essere influenzata da alcune sorgenti luminose (ad esempio, una forte luce LED). Nel complesso, dopo la rimozione del liquido extra, un filtro polarizzatore può eliminare tutti i riflessi dalle fette di cervello; tuttavia, l’immersione del campione nella soluzione tampone è l’approccio più semplice ed economico per le fette di cuore.

Le impostazioni manuali della velocità dell’otturatore, dell’apertura, dell’ISO e del bilanciamento del bianco sono importanti per mantenere il pieno controllo del processo di imaging. Il campione, lo sfondo e le caratteristiche della sorgente luminosa influenzano il sistema di misurazione dell’esposizione della fotocamera in impostazioni automatiche; pertanto, le impostazioni manuali sono necessarie per mantenere costante l’esposizione e il bilanciamento del bianco tra più fotografie durante l’esperimento. Per la fotografia macro, l’impostazione di apertura suggerita è compresa tra f/8 e f/16. Diminuendo l’apertura, la profondità di campo aumenta, il che è utile se l’oggetto non si trova su un singolo piano. Tuttavia, la diffrazione limita la risoluzione totale della fotografia nel caso di aperture più piccole. L’apertura ottimale per la maggior parte degli obiettivi è di solito f/10 perché in questa impostazione, il calo di risoluzione è trascurabile e la profondità di campo è sufficiente. I valori ISO che vanno da 50 a 400 (più basso è meglio) sono in genere ottimali per ridurre al minimo gli artefatti dell’immagine (rumore). La velocità dell’otturatore rimane quindi da modificare per ottenere un’esposizione corretta utilizzando l’apertura menzionata e le impostazioni ISO nelle condizioni di luce esistenti. Le impostazioni manuali sono importanti per un’analisi coerente delle immagini. L’imaging standardizzato garantisce l’uso delle stesse impostazioni di soglia del colore in qualsiasi studio, che richiede l’analisi della segmentazione. Ad esempio, l’analisi semiautomatica da parte del software ImagePro basata su un file di segmentazione con colori predefiniti di blu, rosso e bianco (+ rosa pallido) può essere utilizzata nel corso degli anni se le immagini campione hanno colori coerenti, bilanciamento del bianco ed esposizione.

L’impostazione del bilanciamento del bianco deve essere regolata in base alla temperatura del colore della sorgente luminosa utilizzata per illuminare un campione. Il bilanciamento del bianco può essere selezionato dai preset integrati della fotocamera o utilizzando la calibrazione manuale di un bersaglio grigio. Il vantaggio dell’acquisizione dell’immagine in formato RAW è che il bilanciamento del bianco può essere regolato durante la post-elaborazione software dell’immagine. Poiché i file RAW contengono molte più informazioni rispetto ai file JPEG, la post-elaborazione dei file RAW offre un’eccellente opportunità per la correzione del bilanciamento del colore e dell’esposizione, nonché per ottenere una migliore risoluzione dell’immagine. Poiché la maggior parte delle fotocamere può acquisire file JPEG e RAW contemporaneamente, suggeriamo di acquisire il file RAW e salvarlo come backup.

Nel complesso, questo protocollo descrive una metodologia per l’affettamento e la colorazione del cuore e del tessuto cerebrale del ratto e fornisce linee guida per stabilire l’illuminazione e le configurazioni della fotocamera e le tecniche fotografiche per l’acquisizione di immagini ad alta risoluzione per ulteriori analisi. Questo metodo è applicabile a tutte le fotografie sperimentali di piccoli organi animali.