הכנת לב ורקמות מוח מכרסמים לצילום מאקרו דיגיטלי לאחר איסכמיה-רפרטפוזיה

הכנת הלב לאחר IR מתחילה עם שילוב מחדש של עורקי לב דם וזלוף של צבע כחול לאפליה של אזורים בסיכון מאזורים שאינם בסיכון מאזורים שאינם בסיכון. מתילן כחול או אוונס צבעים כחולים משמשים לעתים קרובות ביותר למטרה ^זו2. כמו לחץ גבוה מדי עלול לפגוע שסתומי לב, ולכן, חלקית או מלאה כתם באזורים בסיכון, עדיף perfuse הלב עם מערכת מבוקרת לחץ, כגון מנגנון Langendorff או גרסה פשוטה של מזרק או משאבה מערכת לחץ הידרוסטטית מצוידת. זלוף מבוקר יבטיח לחץ פיזיולוגי, והצבע בדרך כלל לא ייכנס לאזור הסגור של הלב. הן טכניקות מהירות הזרימה והן טכניקות מבוקרות הלחץ הן אמצעי הגנה מפני overstaining.

אחת הטעויות החמורות ביותר בעיבוד רקמות בר קיימא היא שמירה על רקמות במקפיא במשך זמן ממושך לפני ההכתמה. הקפאה משמשת בעיקר משום שחוקרים רוצים לבצע כתמי לב יום לאחר ניסוי האינפרא-אדום או מאוחר יותר. יתר על כן, הקפאה משמשת כדי להפוך את חיתוך הלב קל יותר. מצאנו כי הקפאה קצרת טווח של הלב עד 5-10 דקות משפיעה בזניחות על שלמות רקמות הלב ומאפשרת לחתוך את הרקמות (במיוחד עבור לבבות עכבר) לפרוסות דקות. עם זאת, הקפאה לתקופות ממושכות פוגעת בקרומים ומפחיתה את הכדאיות של התא ואת תפקוד המיטוכונדריה13. כתוצאה מכך, כתמי TTC של המיטוכונדריה המתפקדת מושפעים, והגבול בין רקמות נמקיות ובת קיימא מסומן בצורה גרועה (מטושטש). בסך הכל, יש להימנע מהקפאת לבבות חולדות, ורק הקפאה קצרת טווח של לבבות עכברים יכולה לשמש לחיתוך קל יותר.

השלב הבא הוא כתמי רקמות בתמיסת TTC של 1% בטמפרטורה של 37 °^{C14 °}. יש להפעיל מראש את תמיסת ההכתמה – חשובה במיוחד להכתמת פרוסות המוח. בעת שימוש בתמיסה שלפני המלחמה, זמן ההכתמה האופטימלי לפרוסות לב הוא 10 דקות. דגירה ארוכה יותר או טמפרטורה גבוהה מ 37 °C (50 °F) תוצאות צבע חום של רקמות הלב. כתמים נכונים של דגימות ועוצמת צבע אדום עקבית חשובים לניתוח תמונה נוסף. בשלבים האחרונים לפני הצילום, פרוסות הרקמה נשטפות 2-3 פעמים עם PBS קר או חיץ דומה להסרת TTC ועודף מתילן כחול מהפתרון כדי למנוע יציקה כחולה בתמונה. יש לצלם פרוסות לב זמן קצר לאחר ההכתמה כדי לקבל את איכות התמונה הטובה ביותר. שרידי כתמי לב באיכות טובה אם מאוחסנים עד 60 דקות בקור (+4 מעלות צלזיוס) PBS. פרוסות מוח מוכתמות ורקמות אבי העורקים מאוחסנות בדרך כלל בתמיסת פורמלדהיד נייטרלית של 4% ושומרות על איכות טובה במשך שבוע. אחסון לילה של רקמות המוח בפורמלין (+4 °C (+4 °C)) אינו פוגע בעוצמת הצבע של רקמות רגילות ומקובל לרכישת תמונה. עם זאת, פורמלין גורם לנפיחות ו destaining של פרוסות הלב. לכן, אחסון של רקמות לב בפורמלין אינו מומלץ.

השלב הבא הוא רכישת תמונה. מעבדות רבות משתמשות בסורקים שטוחים ככלי לרכישת תמונה שצפוי להחליף מצלמה דיגיטלית ומערך תאורה. קבענו כי סריקת הפרוסות אינה מספקת רזולוציית תמונה והפרדת צבע מספקת ולכן אינה מתאימה להדמיית פרוסות לב. בפרט, רזולוציית סורק אינה מספיקה עבור לבבות עכבר, ושמנו לב לעיבוד לקוי של מתילן כחול. לעומת זאת, סורק עשוי להוות חלופה למצלמת צילום להדמיית פרוסות מוח המוכתמות רק ב- TTC או בצבעים בודדים אחרים. לסריקה של פרוסות רקמות, תוכנת סריקה המבטיחה הגדרות חשיפה קבועות היא חיונית. בסך הכל, סורק שטוח הוא פחות מסוגל ולא יכול להחליף מצלמה דיגיטלית עבור רוב יישומי ההדמיה.

הרקע מאחורי דגימות חשוב גם הוא. באופן אידיאלי, החלק התחתון של המגש צריך להיות בצבע שאינו קיים בדגימה המוכתמת. לדוגמה, כדי לכמת את האזור של מתילן כחול וכתם TTC (אדום) באופן אוטומטי או חצי אוטומטי, יש להימנע מרקע לבן, אדום, כחול, צהוב וחום. לכן, רקע ירוק יהיה עדיף. עם זאת, בחירת הצבעים תלויה בהעדפות של האופרטור, אשר מעבד את התמונה לאחר עיבוד התמונה. מדענים רבים מעדיפים רקע לבן מכיוון שניתן למחוק רקע לבן בתמונה לאחר עיבוד ולהמיר ללבן לחלוטין (קוד RGB לבן 255,255,255,255). לאחר מכן, יש להוציא לבן לחלוטין מרשימת הצבעים שנבחרו המשמשים לניתוח חצי-אוטומטי ולספור רק אזורים נמקיים חיוורים, שאינם לבנים לחלוטין אם לא נחשפים יתר על המידה. רקעים כחולים וירוקים מתאימים לצילום של פרוסות מוח ואבי העורקים.

כלי ההדמיה האופטימלי לצילום רקמות הוא רפלקס של עדשה אחת או מצלמה דיגיטלית עדשה הניתנת להחלפה ללא מראה עם עדשת מאקרו תואמת. לכידת עצמים קטנים מאוד עשויה לדרוש שילוב של מצלמה ומיקרוסקופ; עם זאת, לעדשת מאקרו יש בדרך כלל הגדלה מספקת (לפחות 1:2) כדי לקבל תמונות מפורטות של לב עכבר. יצרנים רבים מציעים מצלמות דיגיטליות במחירים סבירים ועדשות מאקרו כדי להשיג צילומים ברזולוציה גבוהה והגדלה גבוהה. לכל המצלמות הדיגיטליות העדכניות יש מאפיינים ופונקציות הדרושים לצילום מאקרו, כולל האפשרות לעלות על מעמד, מספר גבוה של פיקסלים (בדרך כלל >20 Mpx), תצוגה חיה, נעילת מראה, תכונות לשגות זמן, תריס מרחוק, והיכולת להגדיר באופן ידני פרמטרי מצלמה, ובכך להבטיח מהירות תריס קבועה, צמצם, איזון לבן והגדרת ISO. מצלמות קומפקטיות עם התכונות הנ”ל והגדלת העדשה של לפחות 1:2 יכולות לשמש גם לצילום מאקרו. בגלל מאפייני העדשה, כמה מצלמות קומפקטיות צריך להיות ממוקם בסמיכות האובייקט, ואת הנסיין חייב להבטיח כי גוף המצלמה אינו משפיע על התאורה של הדגימה.

לצילום מאקרו עם כל סוג של מצלמת עדשה הניתנת להחלפה, נדרשת עדשת מאקרו הגדלה גבוהה (1:1-1:2). אנו מציעים להשתמש בעדשות מאקרו עם אורך מוקד הנע בין 50 מ”מ ל 100 מ”מ (120) מ”מ או שווה ערך על חיישן מסגרת מלאה (24 מ”מ x 36 מ”מ). למצלמות חיישנים קטנות יותר יש גדלי חיישנים שונים, ויש לחשב מחדש את ההגדלה בהתאם. לצילום של פרוסות לב, מרחק ארגונומי של אלמנט קדמי של עדשת מאקרו 100 מ”מ לנושא הוא כ 150 מ”מ. הגדרה זו מאפשרת למפעילים לשמור את כל הציוד על שולחן, עם גישה נוחה לפקדי המצלמה. עדשת מאקרו 50 מ”מ עשויה להיחשב לצילום של עצמים גדולים יותר, כגון פרוסות מוח, מכיוון ששדה ראייה רחב יותר נחוץ כדי להשיג את כל הפרוסות בתמונה אחת.

כדי להשיג תמונות חדות ברזולוציה גבוהה, יש להתקין מצלמה על מעמד יציב, אשר, יחד עם הגדרת אור, נקרא עמדת צילום צילום. התקנת המצלמה על מעמד והפעלת שלט רחוק (קווית או אלחוטית) מבטלת את רעד המצלמה ומבטיחה מרחק קבוע מהיעד. מערך תאורת מצלמה עם שני מקורות אור קבוע משני הצדדים, בזווית של כ-30-60° ביחס למישור הנושא, מבטיח תאורה מספקת של דגימות ומסייע במניעת השתקפויות בו זמנית. יש להתקין את המצלמה בדיוק כך שהחיישן מקביל למישור הנושא. כדי להאיר באופן שווה את שדה התמונה, שתי המנורות צריכות להיות מכוונות באותה מידה וממוקמות באותו מרחק מהנושא. מקורות אור הממוקמים במרחקים שונים מהנושא גורמים להארה לא אחידה. בנוסף, מקורות אור מהבהבים הם סיבה לשינויים בחשיפה לתמונה. בסך הכל, חשוב למקם במדויק את המצלמה ואת מקורות האור כדי לרכוש במדויק תמונות של דגימות מוארות היטב.

דגימות רקמות משקפות אור (נוצץ), המופיעות ככתמים לבנים בתמונות. כתמי השתקפות אור אלה אינם מכילים מידע צבע שימושי, ובהתאם לכך, חלקים אלה של התמונות אינם יכולים לשמש לניתוח כמותי מדויק של תמונות. השתקפויות אור מפרוסות רקמות ניתן להסיר בשיטות שונות. היעיל ביותר הוא טבילה מלאה של דגימות רקמות במיכל עם תמיסת מלח או PBS. גישה דומה היא החדרת פרוסות רקמות מתחת (או בין) לוחות זכוכית. שיטה זו יעילה נגד השתקפויות; עם זאת, רזולוציית התמונה יכולה להיות נמוכה מזו של תצלומים של רקמות שקועות.

אפשר גם להשתמש במסנן קיטוב המותקן על עדשה כדי לחסל השתקפויות אור. מסנני קיטוב מעגליים זמינים באופן נרחב אך משתנים במידה ניכרת באיכותם בהתאם למחיר, ומסננים זולים יכולים להפחית באופן משמעותי את רזולוציית התמונה. ניתן לסנן אור משתקף על-ידי הפיכת החלק הנע של המסנן המקטב בזווית. היעילות של המסנן המקטב עשויה להיות מושפעת ממקורות אור מסוימים (לדוגמה, נורית LED חזקה). בסך הכל, לאחר הסרת נוזל נוסף, מסנן קיטוב יכול לחסל את כל ההשתקפויות מפרוסות המוח; עם זאת, טבילה לדוגמה בתמיסת המאגר היא הגישה הקלה והחסכונית ביותר עבור פרוסות לב.

הגדרות ידניות של מהירות התריס, הצמצם, ISO ואיזון לבן חשובות לשמירה על שליטה מלאה בתהליך ההדמיה. הדגימה, הרקע והמאפיינים של מקור האור משפיעים על מערכת מדידה של חשיפה למצלמה בהגדרות אוטומטיות; לכן, הגדרות ידניות נחוצות כדי לשמור על חשיפה מתמדת ואיזון לבן בין תצלומים מרובים במהלך הניסוי. עבור צילום מאקרו, הגדרת הצמצם המוצעת היא בין f/8 ל- f/16. על-ידי הקטנת הצמצם, עומק השדה גדל, וזה מועיל אם האובייקט אינו נמצא במישור אחד. עם זאת, עקיפה מגבילה את הרזולוציה הכוללת של הצילום במקרה של פתחים קטנים יותר. הצמצם האופטימלי עבור רוב העדשות הוא בדרך כלל f/10 מכיוון שבהגדרה זו, ירידה ברזולוציה היא זניחה, ועומק השדה מספיק. ערכי ISO הנעים בין 50 ל- 400 (נמוך יותר עדיף) הם בדרך כלל אופטימליים למזעור ממצאי תמונה (רעש). לאחר מכן נותר לשנות את מהירות התריס כדי לקבל חשיפה נכונה באמצעות הגדרות הצמצם וה- ISO שהוזכרו בתנאי האור הקיימים. הגדרות ידניות חשובות לניתוח תמונה עקבי. הדמיה מתוקננת מבטיחה שימוש באותן הגדרות סף צבע לאורך כל מחקר, מה שדורש ניתוח פילוח. לדוגמה, ניתוח חצי-אוטומטי על ידי תוכנת ImagePro המבוסס על קובץ פילוח עם צבעים מוגדרים מראש של כחול, אדום ולבן (+ורוד חיוור) יכול לשמש לאורך השנים אם לתמונות דגימה יש צבעים עקביים, איזון לבן וחשיפה.

יש להתאים את הגדרת האיזון הלבן בהתאם לטמפרטורת הצבע של מקור האור המשמש להארת מדגם. ניתן לבחור איזון לבן מתוך קביעות מוגדרות מראש מובנות של מצלמה או באמצעות כיול ידני של מטרה אפורה. היתרון של לכידת תמונה בפורמט RAW הוא שניתן להתאים איזון לבן במהלך עיבוד תוכנה לאחר עיבוד התמונה. כמו קבצי RAW מכילים הרבה יותר מידע מאשר קבצי JPEG, קובץ RAW לאחר עיבוד מספק הזדמנות מצוינת לתיקון של איזון צבע וחשיפה, כמו גם כדי לקבל רזולוציית תמונה טובה יותר. מכיוון שרוב המצלמות יכולות ללכוד קבצי JPEG ו- RAW בו-זמנית, אנו מציעים ללכוד את קובץ RAW ולשמור אותו כגיבוי.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה עבור הלב החולדה ורקמת המוח חיתוך והכתמה של רקמת המוח ומספק הנחיות להקמת תצורות תאורה ומצלמה וטכניקות צילום לרכישת תמונה ברזולוציה גבוהה לניתוח נוסף. שיטה זו חלה על כל צילום איברים ניסיוני של בעלי חיים קטנים.