Nagetierherz- und Hirngewebevorbereitung für die digitale Makrofotografie nach Ischämie-Reperfusion

Die Vorbereitung des Herzens nach der IR beginnt mit der Reokklusion der Blutherzarterien und der Perfusion von blauem Farbstoff zur Unterscheidung von Risikobereichen aus Nicht-Risikobereichen. Zu diesem Zweck werden am häufigsten Methylenblau- oder Evansblaufarbstoffe ^verwendet2. Da ein zu hoher Druck die Herzklappen schädigen und somit gefährdete Bereiche teilweise oder vollständig verfärben kann, ist es besser, das Herz mit einem druckgesteuerten System wie dem Langendorff-Gerät oder einer vereinfachten Version einer mit einem hydrostatischen Drucksystem ausgestatteten Spritze oder Pumpe zu durchbluten. Kontrollierte Perfusion sorgt für physiologischen Druck, und der Farbstoff dringt normalerweise nicht in die verschlossene Region des Herzens ein. Sowohl Strömungsgeschwindigkeits- als auch druckgesteuerte Techniken sind Schutzmaßnahmen gegen Überfärbung.

Einer der schwerwiegendsten Fehler bei der lebensfähigen Gewebeverarbeitung besteht darin, das Gewebe vor dem Färben längere Zeit in einem Gefrierschrank aufzubewahren. Das Einfrieren wird hauptsächlich verwendet, weil Forscher am Tag nach dem IR-Experiment oder später eine Herzfärbung durchführen möchten. Darüber hinaus wird das Einfrieren verwendet, um das Schneiden des Herzens zu erleichtern. Wir fanden heraus, dass ein kurzzeitiges Einfrieren des Herzens für bis zu 5-10 Minuten die Integrität des Herzgewebes vernachlässigbar beeinträchtigt und das Schneiden des Gewebes (insbesondere bei Mausherzen) in dünne Scheiben erleichtert. Das Einfrieren über einen längeren Zeitraum schädigt jedoch die Membranen und verringert die Zelllebensfähigkeit und die mitochondriale ^Funktion13. Infolgedessen ist die TTC-Färbung der funktionierenden Mitochondrien betroffen, und die Grenze zwischen nekrotischem und lebensfähigem Gewebe ist schlecht abgegrenzt (verschwommen). Insgesamt sollte das Einfrieren von Rattenharts vermieden werden, und nur ein kurzfristiges Einfrieren von Mäuseherzen kann zum leichteren Schneiden verwendet werden.

Der nächste Schritt ist die Gewebefärbung in 1% iger TTC-Lösung bei 37 °^C14. Die Färbelösung sollte vorgewärmt werden – besonders wichtig für die Färbung von Gehirnschnitten. Bei Verwendung der vorgewärmten Lösung beträgt die optimale Färbezeit für Herzscheiben 10 min. Eine längere Inkubation oder eine Temperatur über 37 °C führt zu einer braunen Färbung des Herzgewebes. Die richtige Färbung der Proben und die gleichbleibende Intensität der roten Farbe sind wichtig für die weitere Bildanalyse. In den letzten Schritten vor dem Fotografieren werden die Gewebescheiben 2-3 Mal mit kaltem PBS oder einem ähnlichen Puffer gespült, um TTC und überschüssiges Methylenblau aus der Lösung zu entfernen, um Blauguss auf dem Foto zu vermeiden. Herzscheiben sollten kurz nach dem Färben fotografiert werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Die Herzverfärbung bleibt von guter Qualität, wenn sie bis zu 60 Minuten in der kalten (+4 °C) PBS gelagert wird. Gefärbte Hirnschnitte und Aortengewebe werden normalerweise in einer 4% neutralen Formaldehydlösung gelagert und behalten eine Woche lang eine gute Qualität. Die Nachtlagerung von Hirngewebe in Formalin (+4 °C) beeinträchtigt die Farbintensität von normalem Gewebe nicht und ist für die Bildaufnahme akzeptabel. Formalin induziert jedoch Schwellungen und Färbungen von Herzschnitten. Daher wird die Lagerung von Herzgewebe in Formalin nicht empfohlen.

Der nächste Schritt ist die Bildaufnahme. Viele Labore verwenden Flachbettscanner als Bilderfassungswerkzeug, von dem erwartet wird, dass es eine Digitalkamera und ein Beleuchtungssetup ersetzt. Wir haben festgestellt, dass das Scannen von Scheiben keine ausreichende Bildauflösung und Farbtrennung bietet und daher nicht für die Abbildung von Herzschnitten geeignet ist. Insbesondere ist die Scannerauflösung für Mausherzen unzureichend, und wir haben eine schlechte Darstellung von Methylenblau festgestellt. Im Gegensatz dazu könnte ein Scanner eine Alternative zu einer Fotokamera sein, um Gehirnscheiben abzubilden, die nur mit TTC oder anderen Einzelfarbstoffen gefärbt sind. Für das Scannen von Gewebeschnitten ist eine Scan-Software unerlässlich, die konstante Belichtungseinstellungen gewährleistet. Insgesamt ist ein Flachbettscanner weniger leistungsfähig und kann eine Digitalkamera für die meisten Bildgebungsanwendungen nicht ersetzen.

Der Hintergrund hinter den Proben ist ebenfalls wichtig. Idealerweise sollte der Boden des Tabletts eine Farbe haben, die in der gefärbten Probe nicht vorhanden ist. Um beispielsweise den Bereich der Methylenblau- und TTC-Färbung (rot) auf automatisierte oder halbautomatische Weise zu quantifizieren, sollten weiße, rote, blaue, gelbe und braune Hintergründe vermieden werden. Daher wäre ein grüner Hintergrund vorzuziehen. Dennoch hängt die Farbauswahl von den Vorlieben des Bedieners ab, der das Bild nachbearbeitet. Viele Wissenschaftler bevorzugen einen weißen Hintergrund, da ein weißer Hintergrund in der Bildnachbearbeitung gelöscht und in vollständig weiß umgewandelt werden kann (RGB-Weißcode 255.255.255). Dann sollte man vollständig Weiß aus der Liste der ausgewählten Farben ausschließen, die für die halbautomatische Analyse verwendet werden, und nur blasse nekrotische Bereiche zählen, die nicht vollständig weiß, wenn nicht überbelichtet sind. Blaue und grüne Hintergründe eignen sich für die Fotografie von Hirnschnitten und Aorten.

Das optimale Bildgebungswerkzeug für die Tissuefotografie ist eine spiegelreflexartige oder spiegellose Digitalkamera mit Wechselobjektiv und einem kompatiblen Makroobjektiv. Um sehr kleine Objekte zu erfassen, ist möglicherweise eine Kombination aus einer Kamera und einem Mikroskop erforderlich. Dennoch verfügt ein Makroobjektiv in der Regel über eine ausreichende (mindestens 1:2) Vergrößerung, um detaillierte Bilder eines Mausherzens zu erhalten. Viele Hersteller bieten erschwingliche Digitalkameras und Makroobjektive an, um hochauflösende und stark vergrößerte Fotos zu erhalten. Alle modernen Digitalkameras verfügen über Eigenschaften und Funktionen, die für die Makrofotografie erforderlich sind, einschließlich der Möglichkeit, auf einem Ständer zu montieren, einer hohen Anzahl von Pixeln (normalerweise >20 Mpx), Live-View, Spiegelverriegelung, Zeitrafferfunktionen, Fernauslöser und der Möglichkeit, Kameraparameter manuell einzustellen, wodurch eine konstante Verschlusszeit, Blende, Weißabgleich und ISO-Einstellung gewährleistet werden. Kompaktkameras mit den oben genannten Eigenschaften und einer Objektivvergrößerung von mindestens 1:2 können auch für die Makrofotografie verwendet werden. Aufgrund der Objektiveigenschaften sollten einige Kompaktkameras in unmittelbarer Nähe des Objekts platziert werden, und der Experimentator muss sicherstellen, dass das Kameragehäuse die Beleuchtung der Probe nicht beeinträchtigt.

Für Makrofotografie mit jeder Art von Wechselobjektivkamera ist ein Makroobjektiv mit hoher Vergrößerung (1:1-1:2) erforderlich. Wir empfehlen die Verwendung von Makroobjektiven mit einer Brennweite von 50 mm bis 100 (120) mm oder gleichwertig auf dem Vollformatsensor (24 mm x 36 mm). Kleinere Sensorkameras haben unterschiedliche Sensorgrößen, und die Vergrößerung sollte entsprechend neu berechnet werden. Für das Fotografieren von Herzscheiben beträgt ein ergonomischer Abstand des 100 mm Makroobjektiv-Frontelements zum Motiv ca. 150 mm. Diese Einstellung ermöglicht es dem Bediener, die gesamte Ausrüstung auf einem Tisch zu halten, mit einfachem Zugriff auf die Kamerasteuerung. Ein 50-mm-Makroobjektiv könnte für die Fotografie größerer Objekte wie Gehirnschnitte in Betracht gezogen werden, da ein breiteres Sichtfeld erforderlich ist, um alle Scheiben in einem einzigen Foto zu erhalten.

Um scharfe Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten, sollte eine Kamera auf einem stabilen Ständer montiert werden, der zusammen mit einem Lichtaufbau als Fotokopierständer bezeichnet wird. Die Montage der Kamera auf einem Ständer und einem ferngesteuerten (kabelgebundenen oder drahtlosen) Auslöser eliminiert Verwacklungen der Kamera und sorgt für einen konstanten Abstand zum Ziel. Ein Kamerabeleuchtungsaufbau mit zwei Konstantlichtquellen von beiden Seiten, die etwa um 30-60° relativ zur Motivebene geneigt sind, sorgt für eine ausreichende Ausleuchtung der Proben und hilft, Reflexionen gleichzeitig zu vermeiden. Die Kamera sollte präzise montiert werden, damit sich der Sensor parallel zur Motivebene befindet. Um das Bildfeld gleichmäßig auszuleuchten, sollten beide Lampen gleichmäßig ausgerichtet und im gleichen Abstand zum Motiv platziert werden. Lichtquellen, die in verschiedenen Abständen vom Motiv platziert sind, verursachen eine ungleichmäßige Beleuchtung. Darüber hinaus sind blinkende Lichtquellen ein Grund für Variationen in der Bildbelichtung. Insgesamt ist es wichtig, die Kamera und die Lichtquellen genau zu platzieren, um Bilder von gut ausgeleuchteten Proben präzise aufzunehmen.

Gewebeproben reflektieren Licht (Glitzern), das als weiße Flecken in den Bildern erscheint. Diese Lichtreflexionsflecken enthalten keine nützlichen Farbinformationen, und dementsprechend können diese Teile der Bilder nicht für eine genaue quantitative Analyse von Bildern verwendet werden. Lichtreflexionen von Gewebeschnitten können mit verschiedenen Methoden entfernt werden. Am effizientesten ist das vollständige Eintauchen von Gewebeproben in einen Behälter mit einer Kochsalzlösung oder PBS-Lösung. Ein ähnlicher Ansatz ist das Einführen von Gewebescheiben unter (oder zwischen) Glasplatten. Diese Methode ist effizient gegen Reflexionen; Die Bildauflösung kann jedoch niedriger sein als die von Fotos von eingetauchtem Gewebe.

Man kann auch einen Polarisationsfilter verwenden, der auf einer Linse montiert ist, um Lichtreflexionen zu eliminieren. Zirkular polarisierende Filter sind weit verbreitet, variieren aber je nach Preis erheblich in der Qualität, und billige Filter können die Bildauflösung erheblich reduzieren. Reflektiertes Licht kann abgefiltert werden, indem der bewegliche Teil des Polarisationsfilters in einem Winkel gedreht wird. Die Wirksamkeit des Polarisationsfilters kann durch einige Lichtquellen (z. B. starkes LED-Licht) beeinflusst werden. Insgesamt kann ein Polarisationsfilter nach Entfernung von zusätzlicher Flüssigkeit alle Reflexionen aus den Gehirnscheiben entfernen; Das Eintauchen in Proben in die Pufferlösung ist jedoch der einfachste und kostengünstigste Ansatz für Herzschnitte.

Manuelle Einstellungen der Verschlusszeit, Blende, ISO und des Weißabgleichs sind wichtig, um die volle Kontrolle über den Bildgebungsprozess zu behalten. Die Probe, der Hintergrund und die Eigenschaften der Lichtquelle beeinflussen das Belichtungsmesssystem der Kamera in automatischen Einstellungen. Daher sind manuelle Einstellungen erforderlich, um während des Experiments eine konstante Belichtung und einen konstanten Weißabgleich zwischen mehreren Fotos aufrechtzuerhalten. Für die Makrofotografie liegt die empfohlene Blendeneinstellung zwischen f/8 und f/16. Durch die Verringerung der Blende erhöht sich die Schärfentiefe, was hilfreich ist, wenn sich das Objekt nicht in einer einzigen Ebene befindet. Die Beugung begrenzt jedoch die Gesamtauflösung der Fotografie bei kleineren Blenden. Die optimale Blende für die meisten Objektive ist normalerweise f/10, da in dieser Einstellung der Auflösungsabfall vernachlässigbar ist und die Schärfentiefe ausreichend ist. ISO-Werte im Bereich von 50 bis 400 (niedriger ist besser) sind in der Regel optimal, um Bildartefakte (Rauschen) zu minimieren. Die Verschlusszeit muss dann geändert werden, um eine korrekte Belichtung mit den genannten Blenden- und ISO-Einstellungen bei vorhandenen Lichtverhältnissen zu erhalten. Manuelle Einstellungen sind wichtig für eine konsistente Bildanalyse. Die standardisierte Bildgebung stellt sicher, dass in jeder Studie die gleichen Farbschwellenwerteinstellungen verwendet werden, was eine Segmentierungsanalyse erfordert. Zum Beispiel kann eine halbautomatische Analyse durch die ImagePro-Software, die auf einer Segmentierungsdatei mit vordefinierten Farben Blau, Rot und Weiß (+blassrosa) basiert, im Laufe der Jahre verwendet werden, wenn Probenbilder konsistente Farben, Weißabgleich und Belichtung aufweisen.

Die Weißabgleicheinstellung sollte in Abhängigkeit von der Farbtemperatur der Lichtquelle angepasst werden, die zur Beleuchtung einer Probe verwendet wird. Der Weißabgleich kann aus den in die Kamera integrierten Voreinstellungen oder über die manuelle Kalibrierung eines grauen Ziels ausgewählt werden. Der Vorteil der Bilderfassung im RAW-Format besteht darin, dass der Weißabgleich während der Software-Nachbearbeitung des Bildes angepasst werden kann. Da RAW-Dateien viel mehr Informationen enthalten als JPEG-Dateien, bietet die Nachbearbeitung von RAW-Dateien eine hervorragende Möglichkeit, die Farbbalance und -belichtung zu korrigieren und eine bessere Bildauflösung zu erzielen. Da die meisten Kameras JPEG- und RAW-Dateien gleichzeitig aufnehmen können, empfehlen wir, die RAW-Datei zu erfassen und als Backup zu speichern.

Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine Methodik für das Schneiden und Färben von Herz- und Hirngewebe von Ratten und bietet Richtlinien für die Etablierung von Beleuchtungs- und Kameraeinstellungen sowie Fototechniken für die hochauflösende Bildaufnahme zur weiteren Analyse. Diese Methode ist auf alle experimentellen Kleintierorganfotografien anwendbar.