Préparation du cœur et des tissus cérébraux des rongeurs pour la macrophotographie numérique après ischémie-reperfusion

La préparation du cœur après IR commence par la réocclusion des artères cardiaques sanguines et la perfusion de colorant bleu pour la discrimination des zones à risque des zones non à risque. Les colorants bleu méthylène ou bleu Evans sont les plus fréquemment utilisés à cette ^fin2. Comme une pression excessivement élevée peut endommager les valves cardiaques et, par conséquent, tacher partiellement ou complètement les zones à risque, il est préférable de perfuser le cœur avec un système à pression contrôlée, tel que l’appareil Langendorff ou une version simplifiée d’une seringue ou d’une pompe équipée d’un système de pression hydrostatique. La perfusion contrôlée assurera une pression physiologique et le colorant ne pénètre généralement pas dans la région occluse du cœur. Les techniques de contrôle de la vitesse d’écoulement et de la pression sont des mesures de protection contre les dépassements.

L’une des erreurs les plus graves dans le traitement des tissus viables est de garder les tissus dans un congélateur pendant une période prolongée avant de les tacher. La congélation est principalement utilisée parce que les chercheurs veulent effectuer une coloration cardiaque le lendemain de l’expérience IR ou plus tard. De plus, la congélation est utilisée pour faciliter la coupe du cœur. Nous avons constaté que la congélation à court terme du cœur jusqu’à 5-10 minutes affecte de manière négligeable l’intégrité des tissus cardiaques et facilite la coupe des tissus (en particulier pour les cœurs de souris) en fines tranches. Cependant, la congélation pendant des périodes prolongées endommage les membranes et diminue la viabilité cellulaire et la fonction ^{mitochondriale13}. En conséquence, la coloration TTC des mitochondries fonctionnelles est affectée et la frontière entre les tissus nécrotiques et viables est mal délimitée (floue). Dans l’ensemble, la congélation des cœurs de rat doit être évitée et seule la congélation à court terme des cœurs de souris peut être utilisée pour faciliter la coupe.

L’étape suivante consiste à colorer les tissus dans une solution de TTC à 1 % à 37 °^C14. La solution de coloration doit être préavertée, ce qui est particulièrement important pour la coloration des tranches de cerveau. Lors de l’utilisation de la solution préavertée, le temps de coloration optimal pour les tranches de cœur est de 10 min. Une incubation plus longue ou une température supérieure à 37 °C entraîne une coloration brune des tissus cardiaques. Une coloration appropriée des échantillons et une intensité de couleur rouge constante sont importantes pour une analyse plus approfondie de l’image. Dans les dernières étapes avant la photographie, les tranches de tissu sont rincées 2 à 3 fois avec du PBS froid ou un tampon similaire pour éliminer le TTC et l’excès de bleu de méthylène de la solution afin d’éviter la coulée bleue sur la photographie. Les tranches de cœur doivent être photographiées peu de temps après la coloration pour obtenir la meilleure qualité d’image. La coloration cardiaque reste de bonne qualité si elle est conservée jusqu’à 60 min au froid (+4 °C) PBS. Les tranches de cerveau colorées et les tissus aortiques sont généralement stockés dans une solution de formaldéhyde neutre à 4% et conservent une bonne qualité pendant une semaine. Le stockage de nuit des tissus cérébraux dans du formol (+4 °C) n’altère pas l’intensité de couleur des tissus normaux et est acceptable pour l’acquisition d’images. Cependant, le formol induit un gonflement et une détérioration des tranches de cœur. Par conséquent, le stockage des tissus cardiaques dans le formol n’est pas recommandé.

L’étape suivante est l’acquisition d’images. De nombreux laboratoires utilisent des scanners à plat comme outil d’acquisition d’images qui devrait remplacer un appareil photo numérique et une configuration d’éclairage. Nous avons déterminé que la numérisation des tranches ne fournit pas une résolution d’image et une séparation des couleurs suffisantes et ne convient donc pas à l’imagerie des tranches cardiaques. En particulier, la résolution du scanner est insuffisante pour les cœurs de souris, et nous avons remarqué un mauvais rendu du bleu de méthylène. En revanche, un scanner pourrait être une alternative à un appareil photo pour imager des tranches de cerveau colorées uniquement avec du TTC ou d’autres colorants simples. Pour la numérisation des tranches de tissu, un logiciel de numérisation qui assure des réglages d’exposition constants est essentiel. Dans l’ensemble, un scanner à plat est moins performant et ne peut pas remplacer un appareil photo numérique pour la plupart des applications d’imagerie.

L’arrière-plan derrière les spécimens est également important. Idéalement, le fond du plateau devrait être d’une couleur qui n’est pas présente dans le spécimen taché. Par exemple, pour quantifier la zone de coloration au bleu de méthylène et au TTC (rouge) de manière automatisée ou semi-automatisée, les fonds blancs, rouges, bleus, jaunes et bruns doivent être évités. Ainsi, un fond vert serait préférable. Néanmoins, la sélection des couleurs dépend des préférences de l’opérateur, qui post-traite l’image. De nombreux scientifiques préfèrent un fond blanc car un fond blanc peut être supprimé dans le post-traitement de l’image et converti en blanc complet (code blanc RVB 255,255,255). Ensuite, il faut exclure complètement le blanc de la liste des couleurs sélectionnées utilisées pour l’analyse semi-automatisée et ne compter que les zones nécrotiques pâles, qui ne sont pas complètement blanches si elles ne sont pas surexposées. Les fonds bleus et verts conviennent à la photographie de tranches de cerveau et d’aortes.

L’outil d’imagerie optimal pour la photographie tissulaire est un appareil photo numérique reflex à objectif unique ou à objectif interchangeable sans miroir avec un objectif macro compatible. La capture de très petits objets peut nécessiter une combinaison d’une caméra et d’un microscope; néanmoins, un objectif macro a généralement un grossissement suffisant (au moins 1:2) pour obtenir des images détaillées d’un cœur de souris. De nombreux fabricants proposent des appareils photo numériques et des objectifs macro abordables pour obtenir des photographies haute résolution et à fort grossissement. Tous les appareils photo numériques à jour ont des caractéristiques et des fonctions nécessaires à la photographie macro, y compris la possibilité de monter sur un support, un nombre élevé de pixels (généralement >20 Mpx), la vue en direct, le verrouillage du miroir, les fonctions time-lapse, l’obturateur à distance et la possibilité de régler manuellement les paramètres de l’appareil photo, assurant ainsi une vitesse d’obturation constante, une ouverture, une balance des blancs et un réglage ISO. Les appareils photo compacts avec les caractéristiques mentionnées ci-dessus et un grossissement de l’objectif d’au moins 1: 2 peuvent également être utilisés pour la photographie macro. En raison des caractéristiques de l’objectif, certains appareils photo compacts doivent être placés à proximité de l’objet, et l’expérimentateur doit s’assurer que le boîtier de l’appareil photo n’affecte pas l’éclairage de l’échantillon.

Pour la photographie macro avec n’importe quel type d’appareil photo à objectif interchangeable, un objectif macro à fort grossissement (1:1-1:2) est requis. Nous vous suggérons d’utiliser des objectifs macro avec une distance focale allant de 50 mm à 100 (120) mm ou équivalent sur le capteur plein format (24 mm x 36 mm). Les caméras à capteur plus petites ont des tailles de capteur différentes et le grossissement doit être recalculé en conséquence. Pour la photographie de tranches de cœur, une distance ergonomique de l’élément avant de l’objectif macro de 100 mm par rapport au sujet est d’environ 150 mm. Ce réglage permet aux opérateurs de garder tout l’équipement sur une table, avec un accès facile aux commandes de la caméra. Un objectif macro de 50 mm peut être envisagé pour la photographie d’objets plus grands, tels que des tranches de cerveau, car un champ de vision plus large est nécessaire pour obtenir toutes les tranches d’une seule photographie.

Pour obtenir des images nettes avec une haute résolution, un appareil photo doit être monté sur un support robuste, qui, avec une configuration lumineuse, est appelé un support de copie de photographie. Le montage de la caméra sur un support et une gâchette à distance (filaire ou sans fil) élimine les tremblements de la caméra et assure une distance constante de la cible. Une configuration d’éclairage de caméra avec deux sources de lumière constante des deux côtés, inclinées d’environ 30 à 60 ° par rapport au plan du sujet, assure un éclairage suffisant des échantillons et permet d’éviter les reflets en même temps. La caméra doit être montée avec précision afin que le capteur soit parallèle au plan du sujet. Pour éclairer uniformément le champ d’image, les deux lampes doivent être également orientées et placées à la même distance du sujet. Les sources lumineuses placées à différentes distances du sujet provoquent un éclairage inégal. De plus, les sources de lumière clignotantes sont une raison des variations dans l’exposition de l’image. Dans l’ensemble, il est important de placer avec précision la caméra et les sources lumineuses pour acquérir avec précision des images de spécimens bien éclairés.

Les échantillons de tissus réfléchissent la lumière (scintillement), qui apparaissent sous forme de taches blanches dans les images. Ces taches de réflexion de la lumière ne contiennent pas d’informations de couleur utiles et, par conséquent, ces parties des images ne peuvent pas être utilisées pour une analyse quantitative précise des images. Les reflets lumineux des tranches de tissu peuvent être éliminés par diverses méthodes. Le plus efficace est l’immersion totale des échantillons de tissus dans un récipient contenant une solution saline ou PBS. Une approche similaire consiste à insérer des tranches de tissu sous (ou entre) des plaques de verre. Cette méthode est efficace contre les réflexions; cependant, la résolution de l’image peut être inférieure à celle des photographies de tissus immergés.

On peut également utiliser un filtre polarisant monté sur une lentille pour éliminer les reflets de lumière. Les filtres polarisants circulaires sont largement disponibles, mais leur qualité varie considérablement en fonction du prix, et les filtres bon marché peuvent réduire considérablement la résolution de l’image. La lumière réfléchie peut être filtrée en tournant la partie mobile du filtre polarisant à un angle. L’efficacité du filtre polarisant peut être affectée par certaines sources lumineuses (par exemple, une forte lumière LED). Dans l’ensemble, après élimination du liquide supplémentaire, un filtre polarisant peut éliminer toutes les réflexions des tranches de cerveau; cependant, l’immersion d’échantillons dans une solution tampon est l’approche la plus simple et la plus rentable pour les tranches de cœur.

Les réglages manuels de la vitesse d’obturation, de l’ouverture, de l’ISO et de la balance des blancs sont importants pour maintenir un contrôle total du processus d’imagerie. L’échantillon, l’arrière-plan et les caractéristiques de la source lumineuse influencent le système de mesure de l’exposition de la caméra dans les réglages automatiques; par conséquent, des réglages manuels sont nécessaires pour maintenir une exposition et une balance des blancs constantes entre plusieurs photographies au cours de l’expérience. Pour la macrophotographie, le réglage d’ouverture suggéré est compris entre f/8 et f/16. En diminuant l’ouverture, la profondeur de champ augmente, ce qui est utile si l’objet n’est pas dans un seul plan. Cependant, la diffraction limite la résolution totale de la photographie dans le cas d’ouvertures plus petites. L’ouverture optimale pour la plupart des objectifs est généralement f/10 car dans ce réglage, la baisse de résolution est négligeable et la profondeur de champ est suffisante. Les valeurs ISO qui vont de 50 à 400 (plus bas c’est mieux) sont généralement optimales pour minimiser les artefacts d’image (bruit). La vitesse d’obturation reste ensuite à modifier pour obtenir une exposition correcte en utilisant les réglages d’ouverture et ISO mentionnés dans les conditions d’éclairage existantes. Les réglages manuels sont importants pour une analyse d’image cohérente. L’imagerie standardisée garantit l’utilisation des mêmes paramètres de seuil de couleur tout au long de toute étude, ce qui nécessite une analyse de segmentation. Par exemple, l’analyse semi-automatisée par le logiciel ImagePro basée sur un fichier de segmentation avec des couleurs prédéfinies de bleu, rouge et blanc (+ rose pâle) peut être utilisée au fil des ans si les images d’échantillons ont des couleurs, une balance des blancs et une exposition cohérentes.

Le réglage de la balance des blancs doit être ajusté en fonction de la température de couleur de la source lumineuse utilisée pour éclairer un échantillon. La balance des blancs peut être sélectionnée à partir des préréglages intégrés de la caméra ou à l’aide de l’étalonnage manuel d’une cible grise. L’avantage de la capture d’image au format RAW est que la balance des blancs peut être ajustée pendant le post-traitement logiciel de l’image. Comme les fichiers RAW contiennent beaucoup plus d’informations que les fichiers JPEG, le post-traitement des fichiers RAW offre une excellente occasion de corriger la balance des couleurs et l’exposition, ainsi que d’obtenir une meilleure résolution d’image. Étant donné que la plupart des appareils photo peuvent capturer des fichiers JPEG et RAW simultanément, nous vous suggérons de capturer le fichier RAW et de l’enregistrer en tant que sauvegarde.

Dans l’ensemble, ce protocole décrit une méthodologie pour le tranchage et la coloration des tissus cardiaques et cérébraux de rats et fournit des lignes directrices pour établir des configurations d’éclairage et de caméra et des techniques de photographie pour l’acquisition d’images à haute résolution pour une analyse plus approfondie. Cette méthode est applicable à toutes les photographies expérimentales d’organes de petits animaux.