Knaagdier Hart en Hersenweefsel Voorbereiding voor Digitale Macro Fotografie na Ischemie-reperfusie

De voorbereiding van het hart na IR begint met de reocclusie van hartslagaders in het bloed en de perfusie van blauwe kleurstof voor de discriminatie van risicogebieden van niet-risicogebieden. Methyleenblauw of Evansblauwe kleurstoffen worden het meest gebruikt voor dit ^doel2. Omdat een te hoge druk hartkleppen kan beschadigen en dus gedeeltelijk of volledig vlekgebieden kan veroorzaken, is het beter om het hart te doordrenken met een drukgestuurd systeem, zoals het Langendorff-apparaat of een vereenvoudigde versie van een spuit of pomp met hydrostatisch druksysteem. Gecontroleerde perfusie zorgt voor fysiologische druk en de kleurstof zal meestal niet in het afgesloten gebied van het hart komen. Zowel stromingssnelheids- als drukgestuurde technieken zijn waarborgen tegen overstaining.

Een van de ernstigste fouten bij levensvatbare weefselverwerking is het langdurig bewaren van weefsels in een vriezer voordat ze worden gekleurd. Bevriezing wordt vooral gebruikt omdat onderzoekers de dag na het IR-experiment of later hartkleuring willen uitvoeren. Bovendien wordt bevriezing gebruikt om het snijden van het hart gemakkelijker te maken. We ontdekten dat kortdurend bevriezen van het hart gedurende maximaal 5-10 minuten verwaarloosbaar de integriteit van hartweefsels beïnvloedt en het snijden van de weefsels (met name voor muizenharten) in dunne plakjes vergemakkelijkt. Bevriezing gedurende langere perioden beschadigt echter membranen en vermindert de levensvatbaarheid van de cel en de mitochondriale ^functie13. Als gevolg hiervan wordt de TTC-kleuring van functionerende mitochondriën aangetast en is de grens tussen necrotische en levensvatbare weefsels slecht afgebakend (wazig). Over het algemeen moet bevriezing van rattenharten worden vermeden en kan alleen kortdurende bevriezing van muizenharten worden gebruikt om gemakkelijker te snijden.

De volgende stap is weefselkleuring in 1% TTC-oplossing bij 37 °^C14. De kleuringsoplossing moet worden voorverwarmd , vooral belangrijk voor het kleuren van hersenplakken. Bij gebruik van de voorverwarmde oplossing is de optimale kleuringstijd voor hartplakken 10 min. Een langere incubatie of een temperatuur hoger dan 37 °C resulteert in bruine kleuring van de hartweefsels. Een goede kleuring van monsters en een consistente rode kleurintensiteit zijn belangrijk voor verdere beeldanalyse. In de laatste stappen voor de fotografie worden de weefselplakken 2-3 keer gespoeld met koude PBS of een vergelijkbare buffer om TTC en overtollig methyleenblauw uit de oplossing te verwijderen om blauw gieten op de foto te voorkomen. Hartplakken moeten kort na het kleuren worden gefotografeerd om de beste beeldkwaliteit te verkrijgen. Hartkleuring blijft van goede kwaliteit bij bewaring tot 60 min in de koude (+4 °C) PBS. Gekleurde hersenplakken en aortaweefsels worden meestal opgeslagen in een 4% neutrale formaldehyde-oplossing en behouden een week lang een goede kwaliteit. Nachtelijke opslag van hersenweefsels in formaline (+4 °C) heeft geen invloed op de kleurintensiteit van normaal weefsel en is aanvaardbaar voor beeldacquisitie. Formaline induceert echter zwelling en het vasthouden van plakjes van het hart. Daarom wordt de opslag van hartweefsels in formaline niet aanbevolen.

De volgende stap is beeldacquisitie. Veel laboratoria gebruiken flatbedscanners als een hulpmiddel voor beeldacquisitie dat naar verwachting een digitale camera en verlichtingsopstelling zal vervangen. We hebben vastgesteld dat het scannen van plakjes onvoldoende beeldresolutie en kleurscheiding biedt en daarom niet geschikt is voor het in beeld brengen van hartplakken. Met name de resolutie van de scanner is onvoldoende voor muizenharten en we merkten een slechte weergave van methyleenblauw. Een scanner kan daarentegen een alternatief zijn voor een fotocamera voor het in beeld brengen van hersenplakken die alleen zijn gekleurd met TTC of andere enkelvoudige kleurstoffen. Voor het scannen van weefselplakken is scansoftware die zorgt voor constante belichtingsinstellingen essentieel. Over het algemeen is een flatbedscanner minder capabel en kan een digitale camera niet worden vervangen voor de meeste beeldtoepassingen.

Ook de achtergrond achter exemplaren is belangrijk. Idealiter moet de bodem van de lade van een kleur zijn die niet aanwezig is in het bevlekte exemplaar. Om bijvoorbeeld het gebied van methyleenblauw en TTC (rood) kleuring op een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde manier te kwantificeren, moeten witte, rode, blauwe, gele en bruine achtergronden worden vermeden. Een groene achtergrond zou dus de voorkeur hebben. Niettemin hangt de kleurkeuze af van de voorkeuren van de operator, die de afbeelding nabewerkt. Veel wetenschappers geven de voorkeur aan een witte achtergrond omdat een witte achtergrond kan worden verwijderd in beeldpostprocessing en kan worden omgezet in volledig wit (RGB-witte code 255.255.255). Vervolgens moet men volledig wit uitsluiten van de lijst met geselecteerde kleuren die worden gebruikt voor semi-geautomatiseerde analyse en alleen bleke necrotische gebieden tellen, die niet volledig wit zijn, zo niet overbelicht. Blauwe en groene achtergronden zijn geschikt voor de fotografie van hersenplakken en aorta’s.

De optimale beeldvormingstool voor weefselfotografie is een spiegelreflexcamera of spiegelloze digitale camera met verwisselbare lens en een compatibele macrolens. Het vastleggen van zeer kleine objecten kan een combinatie van een camera en een microscoop vereisen; toch heeft een macrolens meestal voldoende (minimaal 1:2) vergroting om gedetailleerde beelden van een muizenhart te verkrijgen. Veel fabrikanten bieden betaalbare digitale camera’s en macrolenzen om foto’s met een hoge resolutie en hoge vergroting te verkrijgen. Alle up-to-date digitale camera’s hebben kenmerken en functies die nodig zijn voor macrofotografie, waaronder de mogelijkheid om op een standaard te monteren, een groot aantal pixels (meestal >20 Mpx), live view, spiegelvergrendeling, time-lapse-functies, externe sluitertijd en de mogelijkheid om cameraparameters handmatig in te stellen, waardoor een constante sluitertijd, diafragma, witbalans en ISO-instelling wordt gegarandeerd. Compactcamera’s met de bovengenoemde functies en lensvergroting van minimaal 1:2 kunnen ook worden gebruikt voor macrofotografie. Vanwege lenskenmerken moeten sommige compactcamera’s in de buurt van het object worden geplaatst en moet de experimentator ervoor zorgen dat de camerabehuizing de verlichting van het monster niet beïnvloedt.

Voor macrofotografie met elk type camera met verwisselbare lens is een macrolens met een hoge vergroting (1:1-1:2) vereist. We raden aan om macrolenzen te gebruiken met een brandpuntsafstand variërend van 50 mm tot 100 (120) mm of gelijkwaardig op de full-frame (24 mm x 36 mm) sensor. Kleinere sensorcamera’s hebben verschillende sensorformaten en de vergroting moet dienovereenkomstig opnieuw worden berekend. Voor het fotograferen van hartplakken is een ergonomische afstand van het 100 mm macrolens frontelement tot het onderwerp ongeveer 150 mm. Met deze instelling kunnen operators alle apparatuur op een tafel houden, met gemakkelijke toegang tot de camerabediening. Een 50 mm macrolens kan worden overwogen voor het fotograferen van grotere objecten, zoals hersensegmenten, omdat een breder gezichtsveld nodig is om alle segmenten in één foto te verkrijgen.

Om scherpe beelden met een hoge resolutie te verkrijgen, moet een camera op een stevige standaard worden gemonteerd, die samen met een lichtopstelling een fotografie-kopieerstandaard wordt genoemd. Montage van de camera op een standaard en een externe (bekabelde of draadloze) trigger elimineert camerabewegingen en zorgt voor een constante afstand tot het doel. Een camerabelichtingsopstelling met twee constante lichtbronnen van beide zijden, ongeveer 30-60° onder een hoek ten opzichte van het onderwerpvlak, zorgt voor voldoende verlichting van monsters en helpt tegelijkertijd reflecties te voorkomen. De camera moet precies zo worden gemonteerd dat de sensor evenwijdig is aan het onderwerpvlak. Om het beeldveld gelijkmatig te verlichten, moeten beide lampen even georiënteerd zijn en op dezelfde afstand van het onderwerp worden geplaatst. Lichtbronnen die op verschillende afstanden van het onderwerp worden geplaatst, veroorzaken een ongelijke verlichting. Bovendien zijn knipperende lichtbronnen een reden voor variaties in de beeldbelichting. Over het algemeen is het belangrijk om de camera en lichtbronnen nauwkeurig te plaatsen om nauwkeurig beelden van goed verlichte exemplaren te verkrijgen.

Weefselmonsters reflecteren licht (glinsteren), die als witte vlekken in de afbeeldingen verschijnen. Deze lichtreflectievlekken bevatten geen nuttige kleurinformatie en daarom kunnen deze delen van de afbeeldingen niet worden gebruikt voor een nauwkeurige kwantitatieve analyse van afbeeldingen. Lichtreflecties van weefselplakken kunnen op verschillende manieren worden verwijderd. De meest efficiënte is de volledige onderdompeling van weefselmonsters in een container met een zoutoplossing of PBS-oplossing. Een vergelijkbare benadering is het inbrengen van weefselplakken onder (of tussen) glasplaten. Deze methode is efficiënt tegen reflecties; de beeldresolutie kan echter lager zijn dan die van foto’s van ondergedompelde weefsels.

Men kan ook een polarisatiefilter gebruiken dat op een lens is gemonteerd om lichtreflecties te elimineren. Circulaire polarisatiefilters zijn overal verkrijgbaar, maar variëren aanzienlijk in kwaliteit, afhankelijk van de prijs, en goedkope filters kunnen de beeldresolutie aanzienlijk verlagen. Gereflecteerd licht kan worden weggefilterd door het bewegende deel van het polarisatiefilter onder een hoek te draaien. De werkzaamheid van het polarisatiefilter kan worden beïnvloed door sommige lichtbronnen (bijvoorbeeld sterk LED-licht). Over het algemeen kan een polarisatiefilter na verwijdering van extra vloeistof alle reflecties van de hersenplakken elimineren; monsteronderdompeling in bufferoplossing is echter de gemakkelijkste en meest kostenefficiënte aanpak voor hartplakken.

Handmatige instellingen van de sluitertijd, diafragma, ISO en witbalans zijn belangrijk om volledige controle over het beeldvormingsproces te behouden. Het monster, de achtergrond en de kenmerken van de lichtbron beïnvloeden het camerabelichtingsmetersysteem in automatische instellingen; daarom zijn handmatige instellingen nodig om een constante belichting en witbalans tussen meerdere foto’s tijdens het experiment te behouden. Voor macrofotografie ligt de voorgestelde diafragma-instelling tussen f/8 en f/16. Door het diafragma te verkleinen, neemt de scherptediepte toe, wat handig is als het object zich niet in een enkel vlak bevindt. Diffractie beperkt echter de totale resolutie van fotografie in het geval van kleinere diafragma’s. Het optimale diafragma voor de meeste objectieven is meestal f/10 omdat in deze instelling de resolutiedaling verwaarloosbaar is en de scherptediepte voldoende is. ISO-waarden die variëren van 50 tot 400 (lager is beter) zijn meestal optimaal om beeldartefacten (ruis) te minimaliseren. De sluitertijd moet dan nog worden gewijzigd om de juiste belichting te verkrijgen met behulp van de genoemde diafragma- en ISO-instellingen in bestaande lichtomstandigheden. Handmatige instellingen zijn belangrijk voor een consistente beeldanalyse. Gestandaardiseerde beeldvorming zorgt voor het gebruik van dezelfde kleurdrempelinstellingen in elk onderzoek, wat segmentatieanalyse vereist. Semi-geautomatiseerde analyse door ImagePro-software op basis van een segmentatiebestand met vooraf gedefinieerde kleuren blauw, rood en wit (+ lichtroze) kan bijvoorbeeld in de loop der jaren worden gebruikt als specimenafbeeldingen consistente kleuren, witbalans en belichting hebben.

De witbalansinstelling moet worden aangepast afhankelijk van de kleurtemperatuur van de lichtbron die wordt gebruikt om een monster te verlichten. Witbalans kan worden geselecteerd uit ingebouwde presets van de camera of met behulp van de handmatige kalibratie van een grijs doel. Het voordeel van het vastleggen van beelden in RAW formaat is dat de witbalans kan worden aangepast tijdens softwarematige nabewerking van het beeld. Omdat RAW-bestanden veel meer informatie bevatten dan JPEG-bestanden, biedt nabewerking van RAW-bestanden een uitstekende gelegenheid voor de correctie van kleurbalans en belichting, evenals voor het verkrijgen van een betere beeldresolutie. Omdat de meeste camera’s JPEG- en RAW-bestanden tegelijkertijd kunnen vastleggen, raden we aan het RAW-bestand vast te leggen en op te slaan als back-up.

Over het algemeen beschrijft dit protocol een methodologie voor het snijden en kleuren van hart- en hersenweefsel van ratten en biedt het richtlijnen voor het vaststellen van belichtings- en camera-opstellingen en fotografietechnieken voor beeldacquisitie met hoge resolutie voor verdere analyse. Deze methode is toepasbaar op alle experimentele kleindierorgelfotografie.