Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Die richtige zelluläre Funktion hängt von einem Prozess namens Proteostase ab, der sicherstellt, dass funktionelle Proteine in der richtigen Konzentration und zellulären Position sind¹. Versagen in der Proteostase führen zu einer beeinträchtigten Organellenfunktion und sind mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden^2,3,4. Membranproteine stellen einzigartige Herausforderungen an das Proteostasenetzwerk dar, da sie auf die richtige Membran ausgerichtet werden müssen, während die Aggregation aus den hydrophoben Transmembrandomänen (TMDs) vermieden wird⁵. Folglich hat sich eine spezielle Maschinerie entwickelt, um die hydrophobe TMD vom Zytosol abzuschirmen und das Zielen und Einsetzen in die richtige Zellmembran zu erleichtern^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Mitochondrien sind das metabolische Zentrum der Zelle und an zahlreichen essentiellen zellulären Prozessen beteiligt, wie zum Beispiel: oxidative Phosphorylierung, Eisen-Schwefel-Cluster-Erzeugung und apoptotische Regulation^16,17. Diese endosymbiotischen Organellen enthalten zwei Membranen, die als innere mitochondriale Membran (IMM) und äußere mitochondriale Membran (OMM) bezeichnet werden. Über 99% der 1.500 menschlichen mitochondrialen Proteine sind im Kerngenom kodiert und müssen über eine oder zwei verschiedene Membranen transloziert werden^18,19. Die richtige mitochondriale Funktion hängt daher von einem robusten Proteostasenetzwerk ab, um Fehler beim Protein-Targeting oder bei der Translokation zu korrigieren.

Unser Labor konzentriert sich auf eine Untergruppe von mitochondrialen Membranproteinen, die als schwanzverankerte (TA) Proteine bezeichnet werden und eine einzelne Transmembrandomäne am C-Terminus^{20,21,22,23,24}haben. TA-Proteine sind an einer Reihe von essentiellen Prozessen beteiligt, wie Apoptose, Vesikeltransport und Proteintranslokation²⁵. Die einzigartige Topologie von TA-Proteinen erfordert eine posttranslationale Insertion, die im endoplasmatischen Retikulum (ER) durch den geführten Eintritt von Tail-verankerten (GET) oder endoplasmatischen Retikulummembranproteinkomplex (EMC) -Signalwegen oder in das OMM durch einen schlecht charakterisierten Weg^{auftritt 20,26,27,28}. Die biophysikalischen Eigenschaften des TMD sind notwendig und ausreichend, um TA-Proteine zur richtigen Membran zu führen²⁹. Die Erkennung biophysikalischer Merkmale anstelle eines definierten Sequenzmotivs schränkt die Genauigkeit der Targeting-Pfade ein⁵. Daher ist die Fehllokalisierung von TA-Proteinen ein häufiger Stress für die Proteostase-Netzwerke. Zellulärer Stress, wie die Hemmung des GET-Signalwegs, verursacht eine Zunahme der Proteinfehllokalisierung zum OMM und mitochondriale Dysfunktion, es sei denn, diese Proteine werden sofort entfernt^30,31.

Ein häufiges Thema in der Membranproteostase ist die Verwendung von AAA+(ATPase Associated with cellular Activities) Proteinen, um alte, beschädigte oder fehllokalisierte Proteine aus der Lipiddoppelschicht^{1,32,33,34,35,36,37,38} zu entfernen . AAA+-Proteine sind molekulare Motoren, die hexamere Ringe bilden und ATP-abhängigen Bewegungen unterzogen werden, um ein Substrat umzugestalten, oft durch Translokation durch eine schmale axiale Pore^39,40. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um die Extraktion von Membranproteinen durch AAA + ATPasen zu untersuchen, sind die Rekonstitutionen komplex oder beinhalten eine Mischung aus Lipiden und Waschmittel^41,42, was die experimentelle Kraft begrenzt, den Mechanismus der Substratextraktion aus der Lipiddoppelschicht zu untersuchen.

Msp1 ist eine hochkonservierte AAA+ ATPase, die im OMM und in den Peroxisomen verankert ist und eine entscheidende Rolle bei der Membranproteostase spielt, indem sie fehllokalisierte TA-Proteine^{43,44,45,46,47}entfernt. Es wurde kürzlich auch gezeigt, dass Msp1 den mitochondrialen Proteinimportstress lindert, indem es Membranproteine entfernt, die während der Translokation über das OMM⁴⁸zum Stillstand kommen. Der Verlust von Msp1 oder des menschlichen Homologs ATAD1 führt zu mitochondrialer Fragmentierung, Versagen bei der oxidativen Phosphorylierung, Krampfanfällen, erhöhten Verletzungen nach Schlaganfall und frühem Tod^31,49,^{50,51,52,53,54,55,56}.

Wir haben gezeigt, dass es möglich ist, TA-Proteine mit Msp1 ko-rekonstituieren und die Extraktion aus der Lipiddoppelschicht⁵⁷nachzuweisen. Dieses vereinfachte System verwendet vollständig gereinigte Proteine, die zu definierten Liposomen rekonstituiert sind, die das OMM nachahmen (Abbildung 1)^58,59. Diese Ebene der experimentellen Kontrolle kann detaillierte mechanistische Fragen der Substratextraktion angehen, die experimentell unlösbar sind, mit komplexeren Rekonstitutionen, an denen andere AAA+ Proteine beteiligt sind. Hier stellen wir experimentelle Protokolle zur Verfügung, die unsere Methoden zur Liposomenpräparation, zur Membranproteinrekonstitution und zum Extraktionsassay beschreiben. Wir hoffen, dass diese experimentellen Details die weitere Untersuchung des wesentlichen, aber wenig verstandenen Prozesses der Membranproteostase erleichtern werden.